谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶在大肠杆菌中的表达及酶转化生产β-丙氨酸

摘要

[目的]克隆谷氨酸棒杆菌来源L-天冬氨酸α-脱羧酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,并进行酶转化L-天冬氨酸合成p-丙氨酸的研究.[方法]PCR扩增谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶基因pand,构建表达载体pET24a(+)-Pand,转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3),对重组菌进行诱导表达,表达产物经DEAE离子交换层析和G-75分子筛层析纯化后进行酶学性质研究,然后进行酶转化实验,说明底物和产物对酶转化的影响.[结果]重组菌SDS-PAGE分析表明Pand表达量可达菌体总蛋白的50％以上,AccQ·Tag法检测酶活达到94.16 U/mL.该重组酶最造反应温度为55℃,在低于37℃时保持较好的稳定性,最适pH为6.0,在pH 4.0-7.0范围内有较好的稳定性.酶转化实验说明:底物L-天冬氨酸和产物β-丙氨酸对转化反应均有抑制作用;实验建立了较优的酶转化反应方式,在加酶量为每克天冬氨酸3 000 U时,以分批加入固体底物L-天冬氨酸的形式,使100 g/L底物转化率达到97.8％.[结论]重组L-天冬氨酸α-脱羧酶在大肠杆菌中获得高效表达,研究了酶转化生产β-丙氨酸的影响因素,为其工业应用奠定了基础.