兽疫链球菌中与透明质酸合成相关新基因的高通量筛选及克隆

摘要

[目的]兽疫链球菌(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)中透明质酸主要的生物合成途径和相关基因已经被研究得比较透彻,探究一种挖掘与透明质酸合成相关新基因的策略.[方法]利用自杀质粒pSET4s::sacB在宿主基因组中的随机整合作用,筛选具有表型差异突变菌株构建突变体库,进一步利用连接介导PCR (Ligation mediated PCR,LM-PCR)方法和全基因组重测序,检测质粒整合位点,通过基因无痕敲除和回补实验验证插入位点.[结果]构建了包含150株具有表型差异突变株的突变体库;以荚膜合成能力缺失的1号突变株(M1)作为基础研究对象,检测到自杀质粒整合到基因组458 960位点上,破坏了编码塔格糖-6-磷酸激酶的lacC基因;无痕敲除lacC基因得到△lacC,表型分析发现△lacC表现为粘性荚膜特性;进一步全基因组重测序发现,除了lacC基因位点存在插入突变,206 613位点存在碱基G缺失,导致编码透明质酸合成酶的hasA基因发生移码突变,且回补hasA基因后,M1恢复粘性荚膜合成能力.[结论]M1突变株粘性荚膜合成能力的缺失由hasA基因功能缺失引起,与lacC基因功能缺失无关.初步建立了兽疫链球菌中高通量筛选与透明质酸合成相关新基因的策略,为今后挖掘新基因奠定了基础.