固氮施氏假单胞菌亚硝酸盐还原酶基因nirS转录特性及功能鉴定

摘要

[目的]研究固氮施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri) A1501亚硝酸盐还原酶结构基因nirS的转录调控机制及其在反硝化过程中的功能.[方法]构建nirS-lacZ融合载体,利用三亲本结合法将其导入野生型A1501,通过β-半乳糖苷酶活性的测定,分析不同供氧状况、不同浓度的硝酸盐、亚硝酸盐对nirS基因表达的影响;同时将该载体导入rpoN突变株中,研究氮代谢调控因子RpoN对nirS基因转录影响.通过同源重组方法构建nirS突变株,通过生化表型测定明确nirS在反硝化过程中的功能.[结果]启动子活性测定表明,nirS基因厌氧条件下高水平表达,是好氧条件下表达水平的4倍;nirS的表达受硝酸盐诱导,但不受亚硝酸盐的诱导;RpoN突变株中,nirS的表达活性为野生型的1/4,nirS启动子未发现RpoN的保守结合位点,表明nirS的表达受RpoN间接调控.表型测定显示以硝酸盐为电子受体时AnirS的反硝化能力降低了约20％;以亚硝酸盐为电子受体时△nirS仅有微弱的反硝化能力,并且nirS的突变使得菌体在反硝化条件下利用亚硝酸盐的能力显著减弱.nirS突变提高了菌体在亚硝酸为电子受体的反硝化条件下的固氮酶活.[结论]A1501中nirS基因的转录受外界氧及硝酸盐的影响,同时受氮代谢Sigma因子RpoN的调控.nirS在A1501菌反硝化过程中起关键作用,参与了亚硝酸盐的转化.