嗜热棉毛菌木糖苷酶Xyl43基因优化及其在毕赤酵母中高效表达

摘要

[目的]通过外源表达手段构建重组毕赤酵母实现木糖苷酶的高效表达.[方法]基于毕赤酵母密码子偏好性优化嗜热棉毛菌p-木糖苷酶(Xyl43)基因密码子,将其导入毕赤酵母GS115中实现分泌表达,并对重组木糖苷酶酶学性质进行分析.通过单因素实验优化高产菌株的摇瓶发酵条件,并在5L发酵罐中进行扩大培养.[结果]Xyl43基因优化后的序列中222个碱基发生改变,G+C含量由52.8％降低到44.6％,序列一致性为78.17％;将构建的表达载体pPIC9K-OptXyl43电击转入毕赤酵母中,利用平板初筛和摇瓶复筛获得一株高效表达重组菌(命名为P.pastoris GS115-Xyl43);其所产重组木糖苷酶大小为51.5 kD,动力学参数Km为2.93 mmol/L、Vmax为157.9 μmol/(min·mg),最适反应温度55℃,最适pH 7.0,在pH 6.0-9.5条件下具有良好的稳定性;摇瓶优化结果表明:培养基初始pH 6.0、甲醇补加浓度1.0％、培养温度28℃、摇床转速250 r/min为最佳产酶条件,在此条件下发酵144 h胞外酶活达到42 U/mL(蛋白含量0.54 g/L);5 L发酵罐放大培养,发酵156 h(甲醇诱导96 h),木糖苷酶酶活为222.2U/mL,蛋白含量2.36 g/L,较摇瓶提高了4.3倍.[结论]木糖苷酶在毕赤酵母中实现了高效表达,具有较好的工业化应用前景.