嗜热Ⅱ型内含子Tel3c/4c-RT结构域活性位点分析

摘要

【背景】嗜热Ⅱ型内含子是一类由内含子RNA和内含子编码蛋白(intron encoded protein,IEP)组成且在高温条件下能够在染色体上高频移动的反转录转座子,目前已被开发为高效基因打靶工具Thermotargetron,阐明其活性催化位点,对深入研究其“归巢”机制及开发新型遗传工具具有重要意义。【目的】筛选嗜热Ⅱ型内含子Tel3c/4c-RT结构域关键活性位点,并获得失活反转录功能的内含子编码蛋白突变体。【方法】先利用生物信息学技术分析并筛选可能影响Tel3c/4c-RT反转录功能的关键氨基酸位点;然后对筛选到的关键氨基酸位点进行定点突变,并以Thermotargetron质粒为基础构建失活反转录功能的突变型嗜热Ⅱ型内含子打靶系统;最后以大肠杆菌lacZ基因为例,通过蓝白斑计数分析突变型Thermotargetron系统的打靶效率,体内验证Tel3c/4c-RT结构域关键活性位点突变对嗜热Ⅱ型内含子打靶效率的影响。【结果】共筛选到15个可能影响反转录活性的氨基酸位点,包括D194、I195、S196、G197、C198、F199、Q241、G242、R274、Y275、A276、D277、D278、L324和G325。其中,当G242和R274这2个位点突变后,嗜热Ⅱ型内含子Tel3c/4c的“归巢”效率几乎完全丧失,表明G242和R274是影响嗜热Ⅱ型内含子Tel3c/4c-RT结构域反转录功能的最核心催化位点。【结论】筛选并获得影响嗜热Ⅱ型内含子Tel3c/4c-RT结构域反转录功能的关键催化位点,为深入研究嗜热Ⅱ型内含子的“归巢”机制及其功能应用开发奠定了良好的基础。