虾虹彩病毒TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法的建立

摘要

cqvip:【目的】建立检测虾虹彩病毒(SIV)的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR,为实现虾虹彩病毒病(SIVD)快速诊断及疫情监测提供一种新的技术手段。【方法】根据SIV的MCP基因保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,将目的片段克隆至pMD18-T载体制备重组质粒pMD18-T-MCPSIV;优化反应体系及扩增条件后建立检测SIV的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR,以pMD18-T-MCPSIV为标准品绘制标准曲线,并通过特异性、敏感性、重复性试验及临床应用验证其实用性。【结果】制备的重组质粒(pMD18-T-MCPSIV)DNA稳定性好,满足作为标准品的要求;标准品起始模板范围为2.0×101~2.0×109拷贝/反应时,建立的标准曲线具有良好线性关系。优化后的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR灵敏度高,对重组质粒的检测灵敏度可达20拷贝/反应,对虾组织SIV的检测灵敏度约10拷贝/mg,其临床检测的敏感性与套式PCR相当;与虾类其他常见病原无交叉反应,组内和组间变异系数分别为0.27%~0.54%和0.61%~0.95%,且扩增与产物分析同步完成,整个检测过程仅需1 h左右。采用建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR与目前农业农村部推荐的套式PCR同时对276份临床虾样品进行SIV检测,结果显示,两种方法的大部分检测结果一致,符合率为98.6%,但检测低拷贝数样品时前者具有更高的灵敏度。2018和2019年广西虾样品的SIV阳性检出率分别为19.7%和7.5%,且养殖凡纳滨对虾、罗氏沼虾和红螯螯虾均检测到SIV阳性。【结论】基于SIV MCP基因保守序列建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点,适用于虾类样品SIV检测,可为SIVD快速诊断及疫情监测提供一种新的技术手段。