大容量人乳腺癌单链抗体库的构建与初步鉴定

摘要

目的利用细胞内重组技术构建大容量人乳腺癌单链抗体(scFv)库.方法收集30例乳腺癌外周转移淋巴结,依次提取总RNA、mRNA,RT-PCR扩增全套可变区基因(VL、VH),各自克隆到T载体,构建T载体库.然后从T载体上酶切VL、VH分步克隆到噬粒载体pDAN5,经电转化TG1得到初级库.辅助性噬菌体感染初级库,使噬菌体抗体表面呈现.提纯噬菌体抗体,滴定浓度后感染大肠杆菌BS1365进行细胞内重组.噬菌体挽救后再次提纯滴定噬菌体,感染大肠杆菌DH5αF＇,得到次级库,并测序验证.结果 VH、VL T载体库分别为3.5×108和1.7×108,初级库库容量2.5×109.次级库库容量为2.5×1011.结论所采用的引物能够高效扩增目的片段,T载体的应用能够提高抗体基因的克隆效率,细胞内重组将进一步扩大库容量及增加其多样性,这种基于RT-PCR、T载体过渡、细胞内重组的路线能够构建大容量抗体库.