目的:构建敲除TGF-βRⅡ的靶向CLDN18.2的CAR T细胞,并探索其在胃食管交界癌中的治疗潜力;方法:通过CRISPR/Cas9敲除T细胞中的TGF-βRⅡ,并使用慢病毒感染法构建CLDN18.2 CAR T细胞;流式细胞术检测CAR T细胞的阳性率、食管腺癌细胞系中CLDN18.2的表达情况、CAR T细胞中Smad2/3的磷酸化水平以及PD-1的表达水平;免疫荧光法检测CAR T细胞中TGF-βRⅡ的表达;LDH释放实验检测对靶细胞的细胞毒性;裸鼠移植瘤模型检测肿瘤抑制能力;ELISA实验检测肿瘤组织中细胞因子的释放水平;结果:成功构建敲除TGF-βRⅡ的CLDN18.2 CAR T细胞(18.2BBZ/TGFBRKO)以及二代CLDN18.2 CAR T细胞(CLDN18.2);18.2BBZ及18.2BBZ/TGFBRKO在体外对CLDN18.2+的肿瘤细胞具有剂量依赖型细胞毒性;TGF-β1不能使18.2BBZ/TGFBRKO的Smad2/3发生磷酸化,在TGF-β1存在时,18.2BBZ/TGFBRKO与肿瘤细胞共孵育后PD-1的表达水平显著低于18.2BBZ(P<0.001);18.2BBZ/TGFBRKO较18.2BBZ对裸鼠移植瘤的抑制能力更强(P<0.0001),并且在肿瘤组织中保持更强的细胞因子分泌水平(P<0.01);结论:通过CRISPR/Cas9敲除CLDN18.2 CAR T细胞中的TGF-βRⅡ可以有效降低T细胞耗竭,并在小鼠移植瘤模型中产生更强的抑制肿瘤活性,并增加促炎性细胞因子的分泌。
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