无血清悬浮球状培养方法在人源前列腺癌干细胞富集纯化中的应用

摘要

目的:通过无血清悬浮球状培养方法富集纯化人源前列腺癌干细胞并进行小鼠体内外实验验证。方法:采用前列腺癌DU145细胞系,通过无血清悬浮球状培养的方法分离富集、培养纯化出肿瘤干细胞微球(Tumor spheres)。通过流式细胞仪鉴定干细胞表型,并采用动物成瘤实验,将不同数量级的DU145细胞和Tumor spheres细胞接种到NOD/SCID小鼠双侧腋下,观察成瘤率和成瘤速度。对分离富集、培养纯化的Tumor spheres进行诱导分化、增殖水平、活性氧簇、细胞周期检测。为进一步明确Tumor spheres的肿瘤干细胞特性,采用Western blot法检测特异性蛋白的表达,RT-PCR法检测相关mRNA表达。结果:采用无血清悬浮球状培养的方法可使对数生长期DU145细胞分离富集形成Tumor spheres,培养3代可达到纯化的目的,流式细胞技术鉴定其表达前列腺癌干细胞表型CD44(+)CD24(-/low)比例为(63±1)%,明显高于DU145细胞[(33±4)%](P<0.05)。动物成瘤实验显示,接种Tumor spheres侧肿瘤成瘤速度和成瘤率均高于接种DU145细胞侧。Tumor spheres具有更强的自我更新能力和分化潜能,细胞周期检测发现Tumor spheres中(81.67±0.68)%处于细胞周期的G_(0)/G_(1)期(P<0.05),同时Tumor spheres具有更低水平的活性氧簇ROS水平(P<0.05)。Tumor spheres高表达肿瘤干细胞HES1蛋白(P<0.05),Tumor spheres高表达肿瘤干细胞相关Notch1、HES1、HIF-1α、Sox2、Jagged1的mRNA(P<0.05)。结论:无血清悬浮球培养分离纯化DU145肿瘤干细胞的方法简便易行、获取量大、成瘤率高,Tumor spheres具有明确的肿瘤干细胞特性,可作为前列腺癌肿瘤干细胞研究的良好实验模型。