犬瘟热病毒GZ-Z株H基因原核表达载体的构建

摘要

利用实验室构建的含有犬瘟热病毒H基因的pMD18-H质粒,根据其序列设计带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,对H基因ORF进行PCR扩增,得到约1 949 bp的片段.将该片段克隆到pMD18-T载体内,用BamH Ⅰ和HindⅢ进行双酶切鉴定、质粒PCR鉴定,筛选出阳性克隆.将阳性克隆再用BamH Ⅰ和HindⅢ进行双酶切,纯化回收CDV H基因ORF片段;将原核表达载体pET32a(+)用同样的方法酶切,回收载体片段,并用T4连接酶将以上两回收片段连接,构建原核表达载体质粒pET32-H,后经BamHⅠ和HindⅢ双酶切、质粒PCR、测序进行系列鉴定.结果表明,pET32-H原核表达质粒构建成功,其中插入片段大小为1 842 bp,可编码607个氨基酸残基.该实验为下一步H蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备奠定了基础.