基于qPCR检测方法的溺死诊断研究

摘要

目的针对水体中常见的硅藻、蓝藻和气单胞菌,设计相应引物,采用qPCR方法进行检测,验证该方法的特异性和检测灵敏度,并探讨其在溺死诊断中的应用价值。方法设计与溺死相关的浮游生物特异引物ND、UPA、CBR、AER、HLYA、rPOD;扩增20种浮游生物标准株DNA以确定其特异性和灵敏度;检测38只实验兔的肺、肝、肾组织的样本,计算设计的6对引物扩增产物的总体检测阳性率,并与相应的硅藻电镜检验结果对比,验证所建立方法诊断溺死的有效性。结果ND、UPA两对引物能特异扩增硅藻属,CBR能特异扩增蓝藻属,AER、HLYA、rPOD能特异扩增气单胞菌属;以上6对引物扩增产物均能达到0.0001ng的检测灵敏度。实验兔的qPCR检测结果显示,16只溺死兔肺组织均为阳性,且分别有13例肝和14例肾呈阳性,总体诊断阳性14例,阳性率可达87.50%;16只死后浸泡兔和6只空白对照兔中,只有5例死后浸泡兔的肺组织检出阳性,其余皆为阴性。电镜结果显示,16只溺死兔的肺、肝、肾均为阳性,16只死后浸泡兔和6只空白对照兔中,只有5例死后浸泡兔的肺组织电镜检出硅藻阳性,其余皆为阴性,与qPCR结果相一致;经统计学分析,上述两种方法对38只实验兔的总体诊断结果差异没有统计学意义(P=0.49>0.05),对38只实验兔的所有肺、肝、肾样本检测的诊断阳性率差异没有统计学意义(P=0.29>0.05)。结论上述6对引物结合qPCR检测方法进行溺死诊断,具有较高的灵敏度,且特异性较好,具有良好的应用前景。