天花粉蛋白Y14F/R22L定点突变及其活性研究

摘要

利用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术，对天然天花粉蛋白（ｎＴＣＳ）基因在Ｔｙｒ１４和Ａｒｇ２２两个保守残基处同时进行定点突变，即Ｔｙｒ１４变成Ｐｈｅ，Ａｒｇ２２变成Ｌｅｕ，然后克隆到ｐＥＴ－８ｃ高效表达载体上，构建成重组质粒ｐＥＴＹ１４Ｆ／Ｒ２２Ｌ．经序列分析，定点突变的结果与预先设计的完全一致，突变后的天花粉蛋白命名为Ｙ１４Ｆ／Ｒ２２ＬＴＣＳ．将ｐＥＴＹ１４Ｆ／Ｒ２２Ｌ转化到Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＬｙｓＳ）中，进行表达．经ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ柱纯化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定，纯度可达９０％．ＲＩＰ活性测定显示，Ｙ１４Ｆ／Ｒ２２ＬＴＣＳ的活性比ｎＴＣＳ降低了７．５倍，活性变化不显著，因此，ＴＣＳ的Ｔｒｙ１４和Ａｒｇ２２对维持其活性部位构象并不是必需的．但由于Ｙ１４Ｆ／Ｒ２２ＬＴＣＳ在Ｅ．ｃｏｌｉ中的表达量与ｎＴＣＳ相比明显下降，因此，Ｔｙｒ１４和Ａｒｇ２２可能与ＴＣＳ翻译后的折叠有关．