重组人内皮抑素真核表达载体pCD-sEndo的构建和表达

摘要

目的:构建表达人内皮抑素的重组真核表达载体,并将其转染人肝癌SMMC-7721细胞,观察其体外抑制血管生成的活性. 方法:将含有IL-2分泌肽的人endostatin全长cDNA插入真核表达载体pcDNA3.0产生重组质粒pCD—sEndo,利用阳离子脂质体介导将其体外转染人肝癌细胞SMMC- 7721细胞.G418筛选后得到阳性克隆,并被命名为SMMC/sEndo,采用Western—blot检测转染细胞上清中endostatin蛋白的表达,鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成实验检测转染细胞上清中内皮抑素蛋白的生物活性. 结果:成功构建endostatin基因的真核表达质粒pCD—sEndo并经酶切和序列测定证实,通过阳离子脂质体转染SMMC-7721细胞,Western-blot显示转染细胞上清有人endostatin蛋白的表达,Mr 20 000,而转然空质粒对照组未检测到目的蛋白.CAM实验显示在给予内皮抑素蛋白的鸡胚绒毛膜血管稀疏,血管密度明显减少,并且随着蛋白量的增加,血管减少程度加强. 结论:重组endostatin真核表达质粒构建正确,转染SMMC-7721细胞后可有效表达具有生物学活性的人endostatin蛋白并能分泌到细胞外.