靶向mcl-1基因的shRNA真核表达质粒的构建与筛选

摘要

目的:构建靶向髓细胞白血病基因-1(myeloidcell leukemia-1,mcl-1)的shRNA的真核表达质粒,并筛选出沉默mcl-1基因效果最明显的shRNA表达质粒.方法:设计3对针对mcl-1基因不同位点的shRNA片段,构建携带此shRNA片段的真核表达质粒(shRNA1-3)并行酶切鉴定和测序分析.然后通过脂质体将重组质粒转染到肝癌细胞株HepG2中,48h后测定转染率,并分别采用RT-PCR及Western blot检测mcl-1mRNA和蛋白表达情况.结果:重组质粒经酶切鉴定与测序证实构建成功.质粒在HepG2细胞中的转染率约为64%.shRNA1-3导入HepG2细胞48h后,mcl-1mRNA水平和蛋白水平均明显低于空白对照组和阴性对照组(0.61±0.02,0.56±0.02,0.46±0.01vs0.97±0.01,0.95±0.00;0.53±0.01,0.48±0.03,0.36±0.01vs0.90±0.03,0.88±0.01,均P<0.01).与shRNA1和shRNA2相比,shRNA3对mcl-1mRNA和蛋白的抑制作用均最强(52.6%vs36.3%,42.9%;63.2%vs41.5%,49.6%,均P<0.01).结论:成功构建并筛选出的靶向mcl-1的shRNA真核表达质粒对肝癌细胞HepG2内的mcl-1表达具有明显抑制作用.