细菌双杂交系统的优化及其应用

摘要

细菌双杂交系统是一种用于检测体内蛋白质互作的方法,该方法互补腺苷酸环化酶功能,通过检测细胞表达的β-半乳糖苷酶LacZ的活性,分析蛋白质互作能力。但在应用过程中,发现存在操作繁琐、灵敏度低、难实现高通量操作等缺陷。本研究目的是对原有细菌双杂交进行优化,建立一种操作方便、可批量操作、具有较高灵敏度和能够实现实时监测的细菌双杂交系统,本研究成功构建由lacZ启动子控制的luxCDABE的报告质粒pBBR-lacZ-luxCDABE,引入原有的检测系统,新的判读标准并不影响原有的判读标准,本文通过快速灵敏地冷光观察菌落或测定菌液冷光值即可判读结果,优化后的双杂交系统,阳性对照组冷光值为阴性对照组的几十(霍乱弧菌为宿主)至几百倍(大肠杆菌为宿主),阴阳性结果判读差异明显,不仅节约实验成本,提高工作效率,又实现了连续监测。该系统不仅以大肠杆菌为宿主获得成功应用,宿主范围也扩展到霍乱弧菌。该系统通过质粒将lacZ启动子的拷贝数提高,减弱了非腺苷三磷酸(cAMP)因素引起的lacZ启动子活性的干扰,无需繁琐耗时的实验操作,为大批量的蛋白质互作分析及互作蛋白质的筛选提供了有利工具。