TALENs介导的CCR5△32/△32突变赋予CD4^+U87细胞抵抗HIV-1感染的能力

摘要

CCR5Δ32/Δ32(CC chemokine receptor type 5,CCR5)基因型的骨髓干细胞移植,可以治愈感染人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的患者。本研究运用TALENs结合同源重组技术产生纯合子的CCR5△32/△32突变,并赋予CD4^+ U87细胞抵抗HIV-1感染的能力。首先,采用重叠延伸PCR合成CCR5△32 donor DNA。构建CCR5-TALENs和CCR5△1-TALENs质粒,将CCR5-TALENs及CCR5△1-TALENs质粒分别结合CCR5△32 donor DNA,共转染野生型CD4^+ U87细胞。其次,用T7E1酶切分析转染后的TALENs和CCR5△1-TALENs打靶效率。通过单克隆培养筛选CCR5△32/△32突变的单克隆细胞。最后,将CCR5△32/△32 CD4^+ U87细胞和野生型CD4^+ U87细胞进行Bal HIV-1病毒攻击实验,采用ELISA方法检测上清中P24抗原含量。测序结果表明,通过重叠延伸PCR成功获得1 602 bp CCR5△32 donor DNA;CCR5-TALENs质粒第1轮、第2轮和第3轮转染,打靶效率分别为14.80%, 38.20%和50.40%;从29个单个细胞培养的克隆中成功筛选出1个CCR5△32/△1基因型CD4^+ U87细胞,CCR5与CCR5△32 donor DNA之间同源重组效率为1.7%;CCR5△1-TALEN质粒第2轮转染,打靶效率为23.5%,从34个单细胞培养的克隆中筛选出3个CCR5△32/△32基因型CD4^+ U87细胞,CCR5与CCR5△32 donor DNA之间同源重组效率达到8.8%。Bal HIV-1攻击实验表明,野生型CD4^+ U87细胞培养上清第2、4、6、8、10、12 d,平均P24抗原含量分别为58.47±2.35、162.23±4.78、458.78±27.34、613.35±26.78、580.35±24.73、483.34±30.85 pg/mL。而CCR5△32/△32基因型CD4^+U87细胞的培养上清平均P24抗原含量分别为11.30±1.76、5.13±0.88、3.43±0.44、3.84±0.69、3.21±0.44、4.24±0.46 pg/mL。本研究表明,TALENs结合同源重组技术无缝隙地介导了CCR5△32/△32突变,并赋予了CD4^+ U87细胞抵抗HIV-1感染的能力。