大鼠矽肺噬菌体单链抗体库构建

摘要

目的利用噬菌体展示技术构建大鼠矽肺噬菌体单链抗体（Sc Fv）库,为后续筛选矽肺特异性Sc Fv奠定基础。方法无特定病原体级雄性SD大鼠24只,予质量浓度为100 g/L的二氧化硅混悬液1.0 m L经支气管一次性灌注染尘,构建矽肺模型。于造模后第3、6、9和12周分别取6只大鼠周围血淋巴细胞混匀,以Trizol法提取总RNA,逆转录合成cDNA;利用简并引物进行聚合酶链式反应（PCR）,扩增抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的基因,用T4 DNA连接酶连接获得ScFv基因片段,将其与噬菌粒PCANTAB-5e重组,采用氯化钙转化法转化至感受态大肠埃希氏菌（E.coli）TG1中,经M13K07辅助噬菌体超感染,构建矽肺模型大鼠噬菌体ScFv库;随机挑取10个菌落进行质粒双酶切鉴定。结果矽肺模型大鼠周围血总RNA琼脂糖凝胶电泳可见2条明显28S和18S条带,总RNA完整性较好;VH基因片段大小约为400 bp,VL基因片段大小约为350 bp,重组后Sc Fv基因片段长度约为750 bp;M13K07辅助噬菌体扩增后铺双层琼脂平板,见小米粒大小、透亮的噬菌斑,噬菌体滴度为1.35×10^16pfu/L;以重组噬菌粒转化感受态E.coli TG1后铺氨苄青霉素抗性固体平板,计算菌落数为8.0×10^9cfu/L;阳性克隆质粒PCR和双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳显示阳性插入率为90.0%,所建Sc Fv库库容为7.2×10^9cfu/L。结论成功构建矽肺模型大鼠噬菌体Sc Fv库,其库容量及多样性可为后续筛选提供保障。