八肋游仆虫含绿色荧光蛋白基因的大核人工染色体的构建

摘要

为研究八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)相关基因的功能,构建了八肋游仆虫大核人工染色体(macronuclear artificial chromosome ofE.octocarinatus,EoMAC-G),其两端为克隆自八肋游仆虫大核β2-微管蛋白基因的5′和3′非编码区和两侧的端粒序列,中间为多克隆位点和密码子优化后的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP-Eo)报道基因.用脂质体转染方法将携带有EoMAC-G的pBTub-Tel载体转入八肋游仆虫大核,分析EGFP-Eo基因在八肋游仆虫细胞中的表达.荧光显微镜观察发现,EGFP-Eo产生的荧光均匀分布于八肋游仆虫细胞质中.在细胞进行有丝分裂的情况下,荧光可持续20 d以上.相比pEGFP-N1质粒转化的游仆虫,人工染色体中的EGFP-Eo基因表达的荧光亮度强、稳定且持续时间长.Western杂交分析进一步证实,外源EGFP-Eo基因在细胞中过量表达.通过细菌喂食法进行纤毛虫RNA干扰实验,抑制了外源EGFP-Eo基因在八肋游仆虫细胞中的表达.利用构建的人工染色体不仅可以在八肋游仆虫细胞内表达外源基因,对目的蛋白质进行活细胞实时动态的定位分析,还可通过RNA干扰的方法调控外源基因在纤毛虫细胞中的表达,便于进一步分析目的蛋白质的功能.