NRF2信号通路在三氯甲烷致L02细胞氧化应激中的作用

摘要

目的研究核因子E2相关因子2(NRF2)在三氯甲烷致人正常肝细胞株L02细胞氧化应激中的作用。方法(1)以浓度为1、2、4、8、12、16和20 mmol/L的三氯甲烷溶液(以二甲基亚砜溶解)刺激L02细胞,并设对照组和空白组,培养24 h后,以CCK-8比色法检测细胞存活率,筛选三氯甲烷刺激浓度。(2)取对数生长期L02细胞随机分为对照组和低、中、高剂量组,分别以终浓度为0、4、8、12 mmol/L的三氯甲烷染毒24 h后,收获细胞,以比色分析法检测氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力和丙二醛水平,以实时荧光定量聚合酶链式反应法检测NRF2、血红素加氧酶-1(HO-1)、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)和醌氧化还原酶1(NQO1)的mRNA表达,以蛋白质印迹法检测NRF2、HO-1、GCLC和NQO1蛋白的表达。结果(1)当三氯甲烷刺激浓度为4、8、12、16和20 mmol/L时,L02细胞存活率均较对照组出现有统计学意义的下降(P值均<0.05);选择0、4、8和12 mmol/L作为后续实验的三氯甲烷刺激剂量。(2)与对照组比较,3个剂量组L02细胞内SOD和GSH-Px活力均下降(P值均<0.05),丙二醛水平均上升(P值均<0.05),均呈剂量-效应关系。中剂量组L02细胞内CAT活力低于对照组(P<0.05),高剂量组L02细胞内CAT活力低于其余3组(P值均<0.05)。与对照组比较,低剂量组L02细胞中NRF2 mRNA相对表达水平下降(P<0.05),中剂量组L02细胞中NRF2 mRNA相对表达水平升高(P<0.05),高剂量组L02细胞中NRF2mRNA和NRF2蛋白的相对表达水平均升高(P值均<0.05),且3个剂量组L02细胞中HO-1、GCLC、NQO1 mRNA和GCLC、NQO1蛋白的相对表达水平均升高(P值均<0.05)。高剂量组L02细胞中NRF2 mRNA相对表达水平高于低和中剂量组(P值均<0.05),NRF2蛋白相对表达水平高于低剂量组(P<0.05),但HO-1和GCLC mRNA与HO-1蛋白的相对表达水平均低于中剂量组(P值均<0.05)。结论三氯甲烷染毒可通过诱导氧化应激而抑制L02细胞增殖,呈剂量-效应关系;在此过程中,NRF2介导的抗氧化机制被激活,诱导NRF2信号通路下游的抗氧化防御和解毒相关靶基因的表达活化,上调HO-1、GCLC和NQO1的表达,以缓解三氯甲烷所致的氧化损伤。