水稻RNA结合蛋白C3H12与RNA结合位点的鉴定

摘要

CCCH型锌指蛋白质C3H12是进化上保守的RNA结合蛋白质,它含有5个串联的CCCH锌指结构域ZnF1-5,形成2个紧密的锌指簇ZnF1-3和ZnF4-5。早期的研究发现,C3H12可能通过与mRNA结合的方式在转录后水平调控基因的表达。然而,与C3H12结合的mRNA类型和他们的结合模式,并未通过实验得到证明。本文表达纯化了一系列C3H12截短及全长蛋白质,并合成了一些潜在RNA底物ARE9、ARE19及对照Random21。通过等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry,ITC)确定了C3H12与富含腺嘌呤尿嘧啶单元(AU-rich element,ARE)mRNA底物的结合,并揭示了互作核心区域和热力学性质。通过荧光光谱分析和微型热泳动(microscale thermophoresis,MST)技术对ITC的结果进一步佐证。结果表明:(1)C3H12与ARE底物的相互作用是焓驱动的能量有利的(ΔG<0)特异性结合,结合比为1:1。(2)C3H12与ARE19的亲和力较ARE9更高(约2倍)。(3)C3H12中ZnF1-3在与ARE类底物的结合活性中发挥主导作用。(4)C3H12结构中的141个氨基酸残基的接头不直接参与和ARE底物的相互作用。本研究揭示的CCCH型锌指蛋白质C3H12与ARE底物结合模式,将为进一步在分子结构水平阐明C3H12与ARE底物结合的机制奠定基础。