弓形虫GRA4基因真核表达重组质粒的构建与表达

摘要

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的真核表达质粒,并研究其在体外与体内细胞中的表达情况.方法采用PCR方法及克隆技术,构建pVAC-GRA4重组质粒;利用脂质体介导转染法,将该重组质粒导入HEK-293细胞,用RT-PCR法及Western-blot法检测其表达情况;利用基因枪导入法将该重组质粒导入BALB/c小鼠体内细胞,测定免疫鼠T淋巴细胞亚群及IFN-γ、IL-4含量,并观察攻毒试验后小鼠存活情况,以评价其免疫保护力.结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段,成功构建重组表达质粒pVAC-GRA4;转染GRA4的HEK-293细胞,RT-PCR检测可见一条约987bp的目的条带,表达产物经Western-blot鉴定,其分子量约为41kD,能被特异性免疫血清所识别;经pVAC-GRA4免疫后的小鼠,其CD4+T细胞百分率无明显变化(P＞0.05),CD8+T细胞百分率明显增加(与pVAC对照组比较P＜0.05,与空白对照组比较P＜0.01),CD4+/CD8+比值也较空白对照组明显降低(P＜0.01);pVAC-GRA4免疫鼠IFN-γ的A值比对照组略高,但差异无显著性(P＞0.05),IL-4 A值各组间无明显变化(P＞0.05);pVAC-GRA4免疫鼠存活率显著高于两对照组,死亡小鼠的平均存活时间延长(与空白对照组比较P＜0.05).结论构建的真核表达质粒pVAC-GRA4能在HEK-293细胞中和小鼠体内细胞中表达,为弓形虫疫苗的进一步研究打下基础.