刚地弓形虫LDH-Like MDH cDNA的克隆和序列分析

摘要

目的获取弓形虫RH株速殖子苹果酸脱氢酶(MDH)的cDNA全长序列,并对推导翻译出的氨基酸(aa)序列进行分析.方法将NCBI GenBank中登录的弓形虫MDH EST序列进行比对、拼接和电子延伸,发现近5'末端的部分核酸序列缺失.基于分析,设计的上游、下游引物分别包含起始密码子ATG和终止密码子TGA(TGA→UGA),使经RT-PCR扩增出的片段对应完整的CDS或者ORF.之后对MDH CDS推导翻译出的aa序列进行了保守功能域和同源性分析.结果本研究克隆的MDH的cDNA全长951bp,推导翻译出的蛋白质有316个aa组成,约35kDa,与预期大小接近.保守功能域分析表明,弓形虫MDH最接近类-乳酸脱氢酶型(lactate dehydrogenase-like)MDH,其准确定名缩写为LDH-like MDH,同时弓形虫MDH还具有其它脱氢酶类的特征.弓形虫MDH除与隐孢子虫和恶性疟原虫高度同源外,还与很多细菌等物种同源,但与人的同源性最低(22%).弓形虫MDH cDNA序列在NCBI GenBank中登录号为AY650028,对应aa序列的登录号为AAT67462.结论本研究首次获得了弓形虫MDH基因的全长cDNA序列和对应的aa序列.MDH是三羧酸循环中的重要酶类,该酶活性的改变,将直接影响弓形虫的存活.弓形虫MDH aa序列与人MDH蛋白间的同源性很低,提示基于MDH蛋白作为药靶,经高通量技术筛选抗弓形虫药具有可行性.