乙脑病毒嵌套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

摘要

目的建立适用于检测人用猪源性生物制品中外源性乙脑病毒(JEV)的嵌套式RT-PCR方法.方法根据已公布的JEV序列 (GenBank登录号为M55506),设计合成两对引物,对JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK-21细胞抽提RNA进行RT-PCR和RT-nested PCR,将PCR产物进行了克隆测序;同时对猪细小病毒(PPV)、猴空泡病毒40 (SV40)及正常乳鼠脑组织、正常BHK-21细胞、PK15细胞、BSC-1细胞提取核酸进行PCR,并对210份临床样品进行了检测.结果 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测,JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK-21细胞均扩增出1 015 bp和622 bp目的基因片段,而PPV、SV40及未感染JEV的乳鼠脑组织、正常BHK-21细胞、PK15细胞、BSC-1细胞均未见特异性扩增条带,210份猪组织样品中未检出阳性样品.RT-nested PCR检测的最低限度为10 PFU病毒.从样品核酸的提取到PCR扩增及检测结果的报告可在8小时内完成.结论本研究建立的RT-Nested PCR方法具有快速、特异、敏感、可靠的特点,可用于人用猪源性生物制品中外源性JEV的污染检测.