犬钩虫(Ancylostoma caninum)天冬氨酸蛋白酶基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

摘要

目的 对犬钩虫(Ancylostoma caninum)天冬氨酸蛋白酶Asp基因进行了克隆,鉴定,并在原核系统中进行表达.方法 以犬钩虫总RNA为模板,用RT-PCR法对犬钩虫天冬氨酸蛋白酶Asp基因进行扩增,获得的Asp cDNA产物克隆进pMD-18T载体,用PCR筛选阳性克隆.碱裂解法进行质粒提取,单、双酶切进行鉴定并测序.将测序正确的阳性克隆进行双酶切,构建到表达载体pET-32a中,将此重组质粒先转化到E.coli DH5a内,提取质粒,酶切鉴定阳性,再转化入表达宿主 E.coli BL21(DE3)菌株内,对转化菌株用IPTG进行诱导培养.收集培养液,破菌、离心,上清进行SDS-PAGE,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素膜上后进行免疫印迹分析.结果 电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白,所表达蛋白相对分子量为40kDa,抗体检测有特异条带大小为40kDa.结论 成功进行了犬钩虫天冬氨酸蛋白酶Asp基因的克隆表达.