日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆、真核表达及鉴定

摘要

目的 扩增日本血吸虫的酪氨酸羟化酶(Schistosoma japonicum Tyrosine Hydroxylase,SjTH)编码基因,构建pcDNA3.1(+)-SjTH真核表达载体,并检测其在COS-7细胞中的表达情况.方法 以日本血吸虫成虫cDNA为模板,RACE PCR扩增SjTH编码基因,并与pGEM-T连接进行亚克隆,双酶切后回收目的基因,并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,PCR和双酶切初步鉴定后测序,纯化无内毒素重组质粒pcDNA3.1(+)-SjTH,转染入COS-7细胞,G418筛选阳性克隆,RT-PCR和Western blot鉴定重组SjTH蛋白的表达.结果 RACE PCR 扩增出SjTH编码基因,大小约1 392bp,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组真核质粒构建成功.脂质体介导无内毒重组真核质粒pcDNA3.1(+)-SjTH转染入COS-7细胞,G418筛选出阳性克隆,RT-PCR证实阳性单克隆细胞带有SjTH编码基因,Western blot鉴定单克隆细胞表达重组SjTH蛋白,大小约54kD.结论 真核表达载体pcDNA3.1(+)-SjTH构建成功,G418筛选出阳性克隆,真核表达重组SjTH蛋白,为后续研究SjTH蛋白功能奠定基础.