基于CRISPR/Cas12a的室温稳定鼠疫耶尔森氏菌检测体系的建立

摘要

目的筛选并优化冻干保护剂组合,建立可室温稳定储存的、不影响试剂检测灵敏度的Cas12a鼠疫菌核酸检测冻干体系,为其应用于动物鼠疫监测的现场快速检测奠定基础。方法以鼠疫耶尔森氏菌pla基因为靶基因,选择9种常用冻干保护剂加入核酸检测试剂中,筛选有明显保护效果的4种保护剂进行优化。按照正交实验设计原则设计保护剂组合,通过37℃加速破坏实验及26℃室温稳定性实验对复合保护剂进行保护效果和灵敏度评价。结果加入蔗糖、山梨醇和海藻糖3种保护剂的冻干检测体系可在37℃稳定存放2周。室温下存放3个月后体系检测信号强度与37℃加速破坏1周时基本相当,同时检测方法的灵敏度依然能达到10-5 ng/μL,说明Cas12a检测试剂加入筛选得到的保护剂冻干后,可在室温下稳定保存至少6个月。结论本研究构建的室温稳定CRISPR/Cas12a鼠疫菌检测体系可在室温下稳定存放至少半年,能够满足鼠疫菌现场快速检测中对试剂稳定性的需求。同时,本研究获得的复合保护剂组分对构建其它室温稳定CRISPR/Cas12a核酸检测体系具有重要参考价值。