SC79对高糖诱导RPE细胞凋亡的拮抗作用及其对AKT-XIAP信号通路的调控机制

摘要

目的探讨特异性AKT激活剂SC79对体外高糖诱导人视网膜色素上皮(ARPE)-19细胞凋亡的拮抗作用及其潜在机制。方法将体外培养的ARPE-19细胞分别置于含5、10、20μg/ml SC79的高糖(30 mmol/L葡萄糖)培养液中培养6、12、24 h,根据细胞增生率探索最佳的作用浓度和作用时间。将细胞分为4个组,其中正常对照组、甘露醇组和高糖组、分别于含5.6 mmol/L葡萄糖正常培养液、含5.6 mmol/L葡萄糖和24.4 mmol/L甘露醇培养液、高糖培养液中培养48 h,高糖+SC79组细胞于含10μg/ml SC79正常培养液中培养12 h,然后于高糖培养液中继续培养36 h。采用MTS法检测细胞的增生率,采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,采用Western blot法检测磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)、X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)、caspase-9、caspase-3及活化片段active-caspase-3的相对表达量。将细胞分为Neg-shRNA组、AKT shRNA组和空白对照组分别加入相应转染复合物和无血清培养基,采用实时荧光定量PCR检测各转染组Akt mRNA表达。将转染细胞分为Neg-shRNA+SC79组和AKT shRNA+SC79组,参照高糖+SC79组处理方式进行培养,采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。结果不同浓度SC79处理不同时间细胞中以10μg/ml SC79预处理12 h细胞的增生率最高。高糖组细胞增生率明显低于正常对照组、甘露糖组和高糖+SC79组,差异具有统计学意义(均P<0.01)。高糖组细胞凋亡率为(52.27±3.21)%,明显高于正常对照组的(3.90±0.71)%和高糖+SC79组的(20.70±3.62)%,差异均有统计学意义(均P<0.01)。高糖组p-Akt、XIAP、caspase-9及caspase-3蛋白相对表达量明显低于正常对照组和高糖+SC79组,active-caspase-3蛋白相对表达量明显高于正常对照组和高糖+SC79组,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。正常对照组、Neg-shRNA组和AKT shRNA组AKT mRNA相对表达量分别为0.60±0.07、0.59±0.03和0.11±0.10,总体比较差异有统计学意义(F=30.44,P<0.01)。AKT shRNA+SC79组细胞凋亡率明显高于高糖+SC79组和Neg-shRNA+SC79组,差异均有统计学意义(均P<0.001)。结论SC79可以部分拮抗高糖诱导的ARPE-19细胞凋亡,其机制可能与活化AKT/XIAP通路,抑制凋亡执行蛋白caspase家族有关。