MiR-497对角膜新生血管的抑制作用及其靶向STAT3调控机制

摘要

目的探讨miR-497在碱烧伤诱导的角膜新生血管(CNV)形成过程中的作用及其机制。方法选用健康清洁级6~8周龄野生型(WT)C57BL/6小鼠42只以及成功鉴定为CRISPR/Cas9介导的miR-497敲除(KO)和过表达转基因(TG)小鼠各42只,分别作为WT组、KO组和TG组。构建角膜碱烧伤模型,分别于造模后第3、7、14、21天行裂隙灯显微镜检查并进行角膜上皮损伤评分和角膜基质混浊评分,测量CNV面积;采用组织病理染色法观察角膜结构变化和炎症细胞的表达;采用免疫组织化学染色法检测角膜组织中CD31的表达;采用荧光素酶报告基因检测miR-497与信号转导及转录激活蛋白3(STAT3)之间的靶向结合关系;采用实时荧光定量PCR法检测各时间点小鼠角膜组织中miR-497以及血管内皮生长因子A(VEGFA)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-1β、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1 mRNA的相对表达量变化;采用Western blot法检测各组造模后14 d角膜组织中STAT3、p-STAT3蛋白的表达。结果小鼠角膜碱烧伤后出现角膜损伤和炎症细胞浸润,同时出现CNV。角膜上皮损伤评分、角膜基质混浊评分和CNV面积呈现先升高后降低的趋势,并在造模后第14天时达峰值。各组造模后不同时间点角膜上皮损伤评分、角膜基质混浊评分、CNV面积和CD31阳性细胞数总体比较差异均有统计学意义(F_(分组)=49.19、34.56、44.56、77.56,均P<0.01;F_(时间)=51.62、65.62、71.32、46.12,均P<0.01);其中KO组各时间点角膜上皮损伤评分、角膜基质混浊评分、CNV面积和CD31阳性细胞数均高于WT组和TG组,TG组各指标均低于WT组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。在野生型STAT3共转染细胞中,miR-497组荧光素酶活性明显低于miR-阴性对照组和正常对照组,差异有统计学意义(均P<0.05);在突变型STAT3转染细胞中,各组间荧光素酶活性比较,差异无统计学意义(F=0.69,P=0.56)。WT组、KO组、TG组造模后14 d角膜组织中miR-497的相对表达量分别为0.68±0.11、0.41±0.06、1.05±0.14,均明显低于造模前的1.00±0.04、0.56±0.07、1.34±0.11,差异均有统计学意义(均P<0.01)。造模后第14天,KO组STAT3及p-STAT3蛋白相对表达量均明显高于WT组和TG组,TG组各蛋白相对表达量低于WT组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。各组造模后各时间点VEGFA、TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1 mRNA相对表达量均明显高于造模前,KO组各mRNA相对表达量明显高于同时间点WT组和TG组,TG组各mRNA相对表达量明显低于同时间点WT组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论MiR-497可抑制碱烧伤诱导的角膜炎症反应及CNV形成,其可能通过靶向STAT3抑制炎症信号通路的激活。