M13-IN5重组噬菌体的构建与鉴定及其对沙眼衣原体的作用研究

摘要

目的构建针对沙眼衣原体的活性噬菌体, 并评估其对沙眼衣原体的作用。方法将衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白VP1的IN5序列与M13噬菌体重组, 获得重组M13-IN5噬菌体。利用PCR扩增、酶切、测序重组噬菌体基因, 验证目的片段是否成功插入;通过噬菌斑形成实验检测重组噬菌体的活性。利用CCK8法检测效价为1011噬斑形成单位（PFU）/ml的M13噬菌体和M13-IN5重组噬菌体对Hela细胞增殖的影响, 同时设置空白对照组（未感染衣原体的Hela细胞）。Western印迹检测重组噬菌体、M13噬菌体、对数期大肠杆菌ER2738中IN5环蛋白的表达。在沙眼衣原体E型标准株的培养过程中, 分别加入效价为1011 PFU/ml的M13噬菌体、M13-IN5重组噬菌体进行干预, 并设置衣原体对照组。感染后36 h, 共聚焦显微镜下观察M13噬菌体和M13-IN5重组噬菌体定位情况;在感染后36、48、60、72 h碘染色观察计数包涵体。两样本均数间比较用t检验;多组样本均数间比较采用方差分析, 两两比较采用Bonferroni检验。结果成功构建含有IN5环基因的具有生物活性的重组M13噬菌体, Western印迹证实重组噬菌体表达IN5环/pIII融合蛋白, 重组噬菌体效价达3.05 × 1011 PFU/ml。CCK8法检测显示, 空白对照组、M13噬菌体组、M13-IN5噬菌体组A450值分别为3.63 ± 0.01、3.55 ± 0.02、3.70 ± 0.01, 组间差异无统计学意义（F = 12.0, P ＆ 0.05）。共聚焦显微镜定位显示, 噬菌体荧光与衣原体包涵体荧光存在重叠;衣原体感染后36、72 h, M13-IN5噬菌体组和M13噬菌体组包涵体数目较对照组减少（均P ＆ 0.05）, 且M13-IN5噬菌体组包涵体数目较M13噬菌体组有明显降低（P ＆ 0.05）;衣原体感染后48、60 h, M13噬菌体组、M13-IN5噬菌体组与对照组包涵体数目差异无统计学意义（P ＆ 0.05）。结论构建的M13-IN5重组噬菌体具有生物学活性, 且能够成功表达IN5环蛋白;体外实验中, 该噬菌体能进入衣原体包涵体内, 且能明显抑制沙眼衣原体感染。