特异性小干扰RNA下调中期因子基因表达对黑素瘤细胞黏附和侵袭的影响

摘要

目的探讨中期因子（midkine,MK）基因小干扰RNA（siRNA）对黑素瘤细胞侵袭的影响。方法根据MK基因mRNA序列特点,设计并用化学方法合成3个siRNA,转染人黑素瘤A375细胞后,以荧光实时定量PCR方法筛选出效果最好的siRNA,以此siRNA转染人黑素瘤A375细胞。同时设空白对照组（不予任何处理）和空载对照组（仅用脂质体转染）。分别以荧光实时定量PCR和Western印迹方法观察MK基因mRNA和蛋白水平,然后以噻唑蓝法检测细胞黏附率,以Boyden小室模型方法检测细胞侵袭力。结果所设计的siRNA均能有效下调MK基因mRNA表达水平,以S3号作用最强。以该siRNA转染A375细胞后,荧光实时定量PCR结果显示,转染组A375细胞MK基因mRNA水平明显下降,且呈浓度（24 h时r=-0.906;48 h时r=-0.922;72 h时r=-0.939,P均＜0.01）和时间（3.125 nmol/L r=-0.889;6.25 nmol/L r=-0.935;12.5 nmol/L r=-0.928,P均＜0.01）依赖性。细胞黏附试验显示,3.125、6.25和12.5 nmol/L siRNA组黏附率分别为73.66%±2.25%、49.36%±2.16%和28.35%±1.68%,呈浓度依赖性下降（r=-0.936,P＜0.01）。Boyden小室试验结果显示,3.125、6.25和12.5 nmol/L siRNA组穿过滤膜的细胞数分别为23.9±1.6、12.1±1.5、5.6±1.2,而空白对照组为36.8±1.5,穿膜细胞数呈浓度依赖性下降（r=-0.915,P＜0.05）。结论 MK基因在黑素瘤细胞黏附、侵袭中发挥重要作用;以siRNA转染黑素瘤细胞抑制该基因表达可抑制黑素瘤细胞黏附、侵袭能力。