Hsa-mir-634对Vero细胞增殖和凋亡的影响

摘要

目的探讨hsa-mir-634在Vero细胞中的功能与作用机制。方法运用生物信息学方法在线预测hsa-mir-634的潜在靶基因细胞周期蛋白D1（CyclinD1,CCND1）的结合位点,将含有hsa-mir-634结合位点的CCND1的3′UTR片段连人psi-CHECK2载体,构建双荧光报告基因载体。通过定点突变的方法突变hsamir-634和CCND1的结合位点,构建双荧光报告突变基因载体。将构建的重组质粒转染293T细胞,进行双荧光检测;将化学合成的hsa-mir-634模拟物转染Vero细胞,荧光定量PCR和Westem印迹法检测hsa-mir-634对内源性CCND1 mRNA水平和蛋白水平表达的影响,MTS法检测hsa-mir634对Vero细胞增殖能力的影响,流式细胞仪检测hsa-mir-634对Vero细胞凋亡的影响。结果用生物信息学方法成功预测到hsa-mir-634与CCND1的结合位点;测序结果显示,野生型及突变型CCND1 3′UTR序列成功连接到psi-CHECK2报告基因载体;双荧光检测结果显示,过表达hsa-mir-634可以抑制荧光素酶的表达。过表达hsa-mir-634后,其靶基因CCND1在mRNA水平上无明显变化,但可以显著影响CCND1蛋白的表达。过表达hsa-mir-634可抑制Vero细胞增殖,这种抑制作用在转染后第4天最为明显。另外,过表达hsa-mir-634可诱导Vero细胞的凋亡,空白细胞组、阴性对照组及hsa-mir-634过表达组晚期凋亡的比例分别为8.03%、7.96%和17.33%。结论Hsa-mir-634通过影响CCND1的表达影响Vero细胞的增殖和凋亡。