过表达RhoD对人黑素瘤A375细胞骨架和迁移侵袭的影响

摘要

目的探讨RhoD对人黑素瘤细胞株A375细胞骨架、迁移和侵袭能力等的影响及作用机制。方法实验分为A375-RhoD组和A375-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）组, 分别用携带RhoD的慢病毒载体和阴性对照慢病毒载体转染。罗丹明标记鬼笔环肽染色观察细胞骨架, Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭能力, 流式细胞仪检测细胞周期, Western印迹法检测丝切蛋白、磷酸化丝切蛋白、Diaph2和RhoD的表达。结果与A375-EGFP组细胞相比, A375-RhoD组细胞体积增大, 应力纤维变细, 软弱无力, 黏着斑增多;丝状伪足形成增加;皱褶缘和板状伪足无明显变化。Transwell迁移实验显示, A375-EGFP组和A375-RhoD组平均每200倍视野下穿膜细胞数分别为152.67 ± 11.23和72.67 ± 5.03, 两组间差异有统计学意义（t= 11.25, P ＆ 0.05）。Transwell人工基底膜侵袭试验显示, A375-EGFP组和A375-RhoD组平均每200倍视野下穿膜细胞数分别为78.33 ± 12.34和9.00 ± 1, 两组间差异有统计学意义（t = 9.70, P ＆ 0.05）。A375-EGFP和A375-RhoD两组间G1期、S期和G2期细胞所占百分比差异均无统计学意义（P ＆ 0.05）。Western印迹结果显示, A375-RhoD组细胞可在RhoD的刺激下激活下游信号效应分子Diaph2, 促进其表达, 而A375-EGFP组未能激活, 两组间丝切蛋白和磷酸化丝切蛋白表达差异不显著。结论 RhoD过表达可能通过下游效应分子Diaph2调节细胞骨架进而抑制A375细胞的迁移和侵袭能力。