原代人黑素细胞Wnt5A基因沉默的研究

摘要

目的优化Wnt5A特异性siRNA转染原代人黑素细胞的实验条件, 建立沉默Wnt5A基因的模型。方法培养原代人黑素细胞, 将不同浓度（0、20.0、33.3、40.0、60.0 nmol/L）的阳性参照基因GAPDH特异性siRNA通过脂质体法介导转染原代人黑素细胞, 实时荧光定量PCR（qPCR）筛选转染效率最高的siRNA浓度;合成3条Wnt5A-siRNA（Wnt5A-siRNA-793、Wnt5A-siRNA-943、Wnt5A-siRNA-1743）, 分别转染原代人表皮黑素细胞, qPCR法选择干扰特异性最佳的Wnt5A-siRNA;用最佳Wnt5A-siRNA转染原代人黑素细胞, 分别于培养24、48、72 h提取总mRNA及总蛋白, 通过qPCR及Western印迹法确定转染效率最高的时间点。结果 0、20.0、33.3、40.0、60.0 nmol/L GAPDH-siRNA转染原代人黑素细胞后, GAPDH mRNA相对表达量分别为1.009 ± 0.161、0.086 ± 0.010、0.140 ± 0.016、0.285 ± 0.095、0.012 ± 0.007, 组间比较, 差异有统计学意义（F= 69.469, P ＆ 0.05）。60 nmol/L siRNA组GAPDH表达低于其他各组（均P ＆ 0.05）, 干扰效率最佳;各Wnt5A-siRNA组及空白组Wnt5A mRNA相对表达量分别为0.331 ± 0.010、2.229 ± 0.029、0.078 ± 0.006、1.000 ± 0.024, 差异有统计学意义（F= 7 006.094, P ＆ 0.05）。Wnt5A-siRNA-1743组目标分子表达量低于其他3组（均P ＆ 0.05）, 干扰效率最佳。Wnt5A-siRNA-1743转染原代人表皮黑素细胞后24、48、72 h及空白组Wnt5A mRNA相对表达量分别为0.396 ± 0.002、0.026 ± 0.008、0.131 ± 0.079、1.025 ± 0.276, 组间比较, 差异有统计学意义（F= 29.215, P ＆0.05）, 干扰后48 h低于干扰后24、72 h及空白组（均P ＆ 0.05）;Wnt5A蛋白相对表达量分别为112.798 ± 0.218、77.765 ± 0.415、30.540 ± 0.219、130.025 ± 0.158, 组间比较, 差异有统计学意义（F= 79 122.889, P ＆ 0.05）, 干扰后72 h低于干扰后24、48 h及空白组（均P ＆ 0.05）。结论成功建立siRNA沉默人黑素细胞Wnt5A基因的模型。