慢病毒介导shRNA沉默Nicastrin基因的人永生化角质形成细胞模型构建

摘要

目的构建Nicastrin（NCT）基因的RNA干扰慢病毒表达载体, 并在人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）上鉴定其沉默效率, 构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型, 为后续研究NCT基因下调对角质形成细胞的生物学行为影响奠定实验基础。方法设计3个靶向NCT基因特异性短发卡RNA（shRNA）表达序列并连接到慢病毒表达质粒pGLV3/H1/GFP+ Puro中, 成功构建慢病毒重组表达质粒, 并通过测序鉴定。将构建的重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞, 产生慢病毒颗粒, 并测其滴度。将HaCaT细胞分为空白组（未感染病毒）、阴性对照组（NC组, 感染空载病毒LV3-shNC）和干扰组（感染NCT-shRNA1、2、3慢病毒）。流式细胞仪检测慢病毒转染效率, 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western印迹检测靶基因的沉默效率, 筛选出沉默效果最佳的干扰序列。结果测序表明, NCT-shRNA慢病毒重组表达质粒构建成功。重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生的慢病毒颗粒滴度为109 TU/ml。慢病毒感染HaCaT细胞后, 流式细胞仪检测, 慢病毒转染效率大于95%。qRT-PCR结果, 与NC组相比, 干扰组NCT mRNA表达量明显下降, 其中NCT-shRNA1组NCT基因沉默效果最佳, 干扰效率达到75%。Western印迹结果, 与NC组相比, shRNA1组NCT蛋白表达抑制率为71.7%。结论成功筛选出高效NCT-shRNA干扰序列, 构建NCT-shRNA慢病毒重组表达载体, 并构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型。