ADAM28基因原核表达载体的构建和在大肠杆菌中的融合表达

摘要

目的:利用消减杂交技术克隆出牙齿发育相关基因ADAM28.方法:本研究为构建AD-AM28基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导其表达并纯化出ADAM28蛋白;采用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增出ADAM28基因的蛋白编码序列,克隆到中间载体pMD18-T Vector中产生pMD18-T-AD-AM28,再经双酶切得到ADAM28片段定向克隆到pGEX-4T-1载体中,构建融合表达载体pGEX-4T-AD-AM28;在大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达,得到GST-ADAM28融合蛋白,并经SDS-PAGE电泳初步纯化.结果:①成功构建融合表达载体pGEX-4T-ADAM28,并经酶切鉴定、PCR鉴定和测序验证显示插入的ADAM28序列正确,阅读框架完整,未发现突变.②得到初步纯化的GST-ADAM28融合蛋白.经IPTG诱导后出现一条约35.3×103的新蛋白带.结论:ADAM28基因编码蛋白质能够在原核细胞中表达并纯化,为进一步研究该蛋白质的功能打下基础.