HSV-1碱性脱氧核糖核酸酶AN在毕赤酵母中的表达、纯化和活性鉴定

摘要

目的 在毕赤酵母中表达HSV-1复制的关键酶——碱性脱氧核糖核酸酶(alkaline deoxyribonuclease,AN),检测其核酸外切酶活性,从而进一步研究AN的抑制剂.方法 以GenBank发表的HSV-1的17株UL12基因为模板,在不改变UL12氨基酸序列的情况下选择毕赤酵母偏好密码子,设计合成新的基因UL12-2,定向克隆进毕赤酵母表达载体pPIC9K中,经酶切和测序鉴定证明重组载体构建成功.线性化的重组载体pPIC9K-UL12-2,电转化至毕赤酵母菌GS115,用组氨酸缺陷平板选择His+转化子,并进行表型测定,筛选出高抗性转化子.采取甲醇诱导表达,对诱导表达96h的上清进行离子交换层析,SDS-PAGE检测经纯化的AN,并对AN进行核酸外切酶活性检测.结果 重组质粒pPIC9K-UL12-2在GS115中成功分泌表达,表达产物纯化后经SDS-PAGE检测可见目的蛋白条带,目的蛋白显示出核酸外切酶活性.结论 毕赤酵母成功表达了具有核酸外切酶活性的碱性核酸酶AN,为抗HSV-1新药的研发奠定了基础.