猪、牛成纤维细胞α-1,3-半乳糖基转移酶基因的敲除以及人白细胞抗原-G1基因的敲入

摘要

构建了敲除猪α-1,3-GT并敲入人白细胞抗原HLA-G1基因的打靶载体pZJ,其中以新霉素抗性基因(Neo)为正筛选基因,绿色荧光蛋白基因(GFP)为负筛选基因.采用优化的脂质体转染法将打靶载体pZJ转染于一个长势良好的胎猪成纤维细胞系中,经7天G418(600 μg/ml)药物筛选,共获得30个Neo抗性细胞克隆,其中12个为非绿色荧光细胞克隆,7个扩大培养良好,提取阳性克隆细胞的基因组DNA并进行PCR检测.经PCR结果检测,打靶载体转入到胎猪成纤维细胞中,其中3个非荧光阳性单克隆细胞在细胞基因组中进行了定点整合.以同样的脂质体转染条件将pZJ转染牛胎儿成纤维细胞,经筛选并对其进行PCR检测,其中2个均为定点整合阳性.该研究为今后克隆出表达HLA-G1而不表达α-1,3-GT基因的个体猪,从而提供可以真正用于临床的异种器官打下了基础,也为猪牛之间的跨物种敲除提供了一个佐证.