真核细胞内外源性HPV16 E7癌基因表达及其对cdc25A及Cyclin E表达的影响

摘要

背景与目的:人乳头状瘤病毒(HPV)感染及其引发的抑癌基因功能丧失和细胞周期调控失调是宫颈癌发病的重要因素.HPV16诱发宫颈癌的机制主要与其两个早期开放读码框架E6、E7转化基因密切相关.HPVE6、E7引起细胞生长和增殖异常,同时伴有Cyclin A、Cyclin D1、CDK4等细胞周期蛋白的表达异常.本研究采用体外基因转染技术将HPV 16 E7基因转入靶细胞,通过对目的基因瞬时表达的检测,进而观察在E7病毒癌蛋白的影响下调控G1/S检验点的几种细胞周期调节蛋白的表达,以探讨HPV16型E7基因外源性表达对子宫颈癌HeLa细胞细胞周期调节因子cdc25A及细胞周期蛋白E(Cyclin E)的影响.方法:从宫颈癌标本中经PCR扩增回收HPV16E7基因片段,将其插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1构建重组腺病毒基因组Ad-E7.用脂质体介导Ad-E7导入包装细胞人胚肾细胞系HEK-293细胞,包装出完整腺病毒颗粒.测定病毒上清液滴度,感染体外培养的HeLa细胞.采用RT-PCR方法检测转染前后HeLa细胞cdc25A的mRNA表达的差异;激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测转染前后Cyclin E表达的差异.结果:荧光显微镜下,转染后HEK-293细胞和HeLa细胞表达绿色荧光蛋白.RT-PCR结果显示转染后,HeLa细胞cdc25A的mRNA含量较转染前显著增加[感染前灰度值0.23±0.10,感染后0.87±0.22(P＜0.01)],LSCM检测结果显示转染后Cyclin E表达较转染前明显增加.结论:重组腺病毒可以成功介导外源性HPV16E7基因在HeLa细胞内表达,HPV16E7基因促进HeLa细胞周期调节因子cdc25A和Cyclin E的表达.