环状RNA hsa_circ_0001573对乳腺癌细胞生物学行为的影响及机制研究

摘要

背景与目的:环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类呈闭合环状结构的非编码RNA,在基因表达调控方面具有重要的潜能。CircRNA与肿瘤的发生、发展密切相关。本研究旨在探讨hsa_circ_0001573对乳腺癌细胞生物学行为的影响及机制。方法:收集重庆医科大学附属第一医院2020年1月—2021年1月经手术切除的4例乳腺癌组织和癌旁组织,通过RNA微阵列芯片分析(microarray analysis)技术进行分析,并采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)验证40例乳腺癌组织和癌旁组织以及正常人乳腺上皮细胞MCF-10A和乳腺癌细胞(MCF-7和SK-BR-3)中hsa_circ_0001573的相对表达量。采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)实验进一步检测其在细胞中的定位与表达。转染干扰质粒后,采用细胞计数试剂盒(cellcountingkit-8,CCK-8)、EdU实验检测细胞增殖;通过transwell小室实验、伤口愈合实验和克隆形成实验分别检测细胞侵袭和迁移;采用Hoechst33342、TUNEL与流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。采用蛋白质印迹法(Western blot)检测CCND1、CCND2和CDK4的表达。探讨hsa_circ_0001573对裸鼠移植瘤生长的影响。采用RNA pull down实验检测与hsa_circ_0001573相互作用的蛋白,荧光原位杂交联合免疫荧光(fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence,FISH-IF)进一步检测hsa_circ_0001573与GNB4的亚细胞共定位,探究潜在的分子机制。结果:hsa_circ_0001573在乳腺癌组织(P<0.05)和乳腺癌细胞(P <0.001)中显著上调,敲低hsa_circ_0001573能抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡,降低CCND1、CCND2和CDK4的相对表达量。体内实验结果表明,敲低hsa_circ_0001573可抑制移植瘤生长。RNA pull down实验显示,hsa_circ_0001573与GNB4蛋白结合,FISH-IF表明hsa_circ_0001573与GNB4共定位于乳腺癌细胞中,且与GNB4相互作用能促进c-myc的表达。结论:环状RNA hsa_circ_0001573在乳腺癌中高表达,敲低hsa_circ_0001573对细胞增殖、侵袭能力及细胞凋亡和细胞周期有调控作用,并在体内抑制移植瘤生长,可通过与GNB4蛋白的相互作用,本研究结果可望为乳腺癌治疗提供新靶点。