测定化学物对乙酰胆碱酯酶抑制毒性的微板吸光法研究

摘要

随着化学污染物种类与数量的日益增多,高通量测试方法显得越来越重要.基于乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制法原理,以多功能酶标仪为测试设备,96孔微板为暴露反应载体,建立了测定化学物对AChE抑制毒性的微板吸光法.系统研究了AChE浓度、碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)浓度、二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)浓度对显色吸光度、吸光度变化速率、化学物测试毒性的影响.结果表明,随着AChE、DTNB、ATCI的浓度增加,吸光度均增加;吸光度变化速率与AChE浓度呈正相关,与DTNB浓度基本无关,与ATCI浓度呈现先增后减的双相关系;随着ATCI浓度增加,灭多威剂量-效应曲线(DRC)向右移动.最终建立的优化测试条件为DTNB 0.2 g·L-1、ATCI 0.2 g·L-1、AChE 0.04 U·mL-1、pH 6.8、反应温度29℃及暴露时间15 min;并与国标方法进行了对比与验证,发现试剂加样顺序对毒性测定结果有显著影响.基于AChE的微板毒性测试结果表明,灭多威的DRC呈现良好的S型曲线,可用Weibull函数有效表征,拟合决定系数R2大于0.97,空白变异控制在了±10％以内.此方法可用于化学污染物的高通量毒性检测.