LncRNA13164通过ace-miR-4968-y调节中华蜜蜂幼虫对蜜蜂球囊菌侵染的免疫应答

摘要

【目的】长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)可通过竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)等多种方式发挥重要的调控作用,但蜜蜂lncRNA的功能研究至今依然缺失,lncRNA在蜜蜂免疫应答中的作用尚不清楚。本研究旨在揭示中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫响应蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)侵染的免疫应答中lncRNA的调控功能及作用机制。笔者团队前期通过深度测序和生物信息学分析发现,lncRNA13164与ace-miR-4968存在靶向关系且潜在参与在中蜂幼虫对蜜蜂球囊菌侵染的应答。【方法】利用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测蜜蜂球囊菌接种后中蜂幼虫肠道内lncRNA13164的表达谱。采用ILoc-LncRNA软件预测lncRNA13164的亚细胞定位。联用RNAhybrid、Miranda和TargetScan软件预测lncRNA13164靶向的miRNA及miRNA靶向的mRNA。通过PCR和RT-qPCR验证lncRNA13164和ace-miR-4968的真实表达及二者间的结合关系。通过饲喂dsRNA对蜜蜂球囊菌侵染的中蜂幼虫肠道内lncRNA13164进行RNAi,进而检测lncRNA13164的沉默效果及ace-miR-4968和3个免疫基因(stk、e3ul和or1)的相对表达量。【结果】相较于未接种组,lncRNA13164的表达量在蜜蜂球囊菌接种组4日龄幼虫肠道内上调,在5和6日龄幼虫肠道内显著上调。LncRNA13164可靶向ace-miR-4968等15个miRNA并形成1个调控网络。ace-miR-4968共靶向79个基因,可注释到17个基因本体论(gene ontology,GO)条目和85条京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路。LncRNA13164与ace-miR-4968在中蜂幼虫肠道内均真实表达。相较于未接种组,接种组5日龄幼虫肠道内ace-miR-4968-y极显著下调表达,与lncRNA13164的表达趋势相反。相较于dsRNA-egfp饲喂组,dsRNA-lncRNA13164饲喂组5和6日龄幼虫肠道内lncRNA13164的表达量均极显著下调(P<0.01),沉默效率分别为66.05%和56.45%。沉默lncRNA13164后,ace-miR-4968的表达量在5日龄幼虫肠道内极显著上调,stk、e3ul和or1的表达量均显著下调(P<0.05)。【结论】饲喂dsRNA可有效沉默中蜂幼虫肠道内lncRNA13164的表达,lncRNA13164通过ace-miR-4968调控丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine-protein kinase Doa isoform X4)基因stk、E3泛素蛋白连接酶(E3 ubiquitin-protein ligase,MYLIP)基因e3ul和抗氧化蛋白1亚型X6(oxidation resistance protein 1 isoform X6)基因or1表达,进而介导宿主对蜜蜂球囊菌侵染的免疫应答。