犬冠状病毒S1蛋白特异性小分子抗体Fab的制备

摘要

为表达犬冠状病毒（canine coronavirus, CCV）S1蛋白，制备其特异性小分子抗体Fab,为CCV的防治提供新材料。采用PCR扩增CCV S1基因全长及其截短片段，分别克隆到原核表达载体pET28a或pGEX4T-1中，转到BL21（DE3）或Rosetta（DE3）感受态细胞构建重组表达菌株；用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导目的蛋白表达，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blot鉴定分析重组蛋白；纯化蛋白分别与ISA71AVG或ISA201VG佐剂配伍乳化后制备免疫原，免疫蛋鸡，用聚乙二醇（PEG）沉淀法提取得到CCV S1蛋白的卵黄抗体，通过Western blot检测抗体滴度，用胃蛋白酶水解卵黄抗体制备小分子抗体Fab。结果显示，S1蛋白全长无表达，CCV S1-a和CCV S1-b分子量分别为79 ku和68 ku。在免疫后第35天2种佐剂组的卵黄抗体滴度可达1∶128 000。制备小分子抗体Fab最佳酶切条件为卵黄抗体与胃蛋白酶混合质量比20∶1、pH值4.1、37℃酶切8 h。完整的IgY可以与CCV呈特异性反应，胃蛋白酶处理后制备的小分子抗体Fab可以有效阻断CCV的感染性。综上，本研究成功表达了CCV S1的2个截短片段蛋白，制备了卵黄抗体及其小分子抗体Fab,为进一步开展犬冠状病毒病的诊断和防治技术研究奠定了基础。