血管靶向光动力治疗药竹红菌乙素脂质体的药效学、药代学及光毒性研究

摘要

目的：探讨竹红菌乙素脂质体（liposomalHypocrellinB）对鼠肺血管内皮细胞（pulmonarymicrovascularendothelialcells，PMVECS）、棕色挪威（BrownNorway，BN）大鼠脉络膜新生血管（choroidalneovascularization，CNV）动物模型的光动力效应、在正常小鼠体内的药动学过程以及对小鼠皮肤的光毒性，为HB脂质体应用于临床提供实验依据。
　　方法：1.HB脂质体对鼠肺血管内皮细胞的光毒性和暗毒性研究。光毒组采用不同浓度HB脂质体与鼠肺血管内皮细胞孵育4h后，予以波长578.2nm黄光照射，功率密度20mW/cm2，能量密度20J/cm2，照射后继续孵育24h，用MTT法测定细胞存活率。暗毒组，用不同浓度HB脂质体在避光条件下与鼠肺血管内皮细胞孵育24h，用MTT法测定细胞存活率，计算HB脂质体的光毒半数杀伤浓度及暗毒半数杀伤浓度，并与HB进行比较。
　　2.CNV模型建立。24只BN大鼠随机分为氪激光光凝后3d、7d、14d、21d、28d和56d组，共6组，用波长647nm、功率260mW、光斑直径50μm、曝光时间200ms的氪激光围绕视乳头避开大血管进行光凝，每只眼8点。通过眼底荧光素钠造影（fundusfluoresceinangiography,FFA）图像和病理组织学改变。观察激光光凝后3d-56d激光诱导CNV的演变过程。将成膜良好的动物纳入下一步实验。
　　3.将氪激光光凝后21d的CNV模型鼠20只随机分为空白对照组（N，4只）和光动力治疗组（16只，根据给药剂量及PDT治疗之后观察时间分为A、B、C、D四个亚组）。所有治疗组均经大鼠股静脉注射HB脂质体，A、B两组采用1mg/kgC、D两组采用2mg/kg，所有治疗组均在静脉注射药物后20min，以功率密度400mW/cm2，能量密度36J/cm2，波长578.2nm黄光照射眼底，眼底光斑直径皆为1000μm。治疗后24h和7d行FFA检查和组织病理学检查判断疗效。空白对照组不予任何处理。
　　4.HB脂质体的初步药代动力学研究。将72只正常小鼠随机分成12个试验组，每组6只，每组对应一个时间点（静脉注射前及注射后即刻、5、10、20、30、60、90、120、180、240、360min），按2mg/kg剂量一次性尾静脉注射药物后，用荧光法检测不同时间点的血药浓度，用DAS2.1.1（drugandstatisticsforwindows）程序软件拟合，血药浓度-时间曲线进行自动房室模型的判别及药动学参数的计算。
　　5.HB脂质体对小鼠皮肤的光毒性研究。将200只昆明小鼠随机分为4组，分别为生理盐水对照组，HB脂质体1mg/kg组，HB脂质体2mg/kg组，HB脂质体4mg/kg组。均采用尾静脉注射一次性给药。小鼠于给药后的不同时间接受相同强度的模拟太阳光照射60min。用6mm打孔器取左、右耳廓各l耳片称重。通过小鼠耳片重量变化及背部去毛区、耳朵、病理组织学检查评价皮肤光毒性。
　　结果：
　　1.HB脂质体在照光及非照光条件下，对鼠肺微血管内皮细胞的杀伤浓度分别为53.45ng/mL和17.58μg/mL。光毒半数杀伤浓度与HB无明显差异，暗毒半数杀伤浓度为HB的87倍。
　　2.FFA显示光凝后3dCNV开始形成。组织病理显示21d以后CNV的纤维血管状态维持相对稳定状态。
　　3.各实验组PDT后24h、7d未闭合CNV百分比与对照组相比大大降低，有统计学意义（p＜0.01）。2mg/Kg组CNV闭合率高于1mg/Kg组，2mg/Kg组对正常视网膜、脉络膜的损伤为5级，1mg/Kg组对正常视网膜、脉络膜的损伤为2级。HB脂质体所需光照剂量、光敏剂用量及对正常视网膜、脉络膜损伤三方面均低于HMME及Verteporfin。
　　4.正常小鼠按2mg/kg一次性尾静脉注射给药后，血清的药-时曲线为三室模型一级吸收，其主要药动学参数为：t1/2z=(2.319±0.462)h，Tmax=(0.127±0.048)h，Cmax=(51.105±2.869)mg/L。
　　5.HB脂质体皮肤光毒实验各光敏剂剂量组的耳片重量与对照组耳片重量差异无统计学意义。给药后1天，HB脂质体4mg/kg光照组有2例动物耳缘皮肤组织真皮内小血管充血，有炎细胞浸润，余均未见异常。
　　结论：
　　1.HB脂质体对鼠肺微血管内皮细胞的光动力杀伤效果明显。安全性比HB高。
　　2.HB脂质体-PDT治疗CNV疗效确切，优势凸显。在光照剂量一定的情况下，CNV闭合率呈光敏剂剂量依赖型，对正常视网膜、脉络膜的损伤亦呈光敏剂剂量依赖型。还需进一步研究合适的光照剂量及光敏剂剂量，在最大限度提高CNV闭合率的同时，最低限度降低对正常视网膜及脉络膜的损伤，以达到光照剂量及光敏剂剂量的最大优化。
　　3.HB脂质体在正常小鼠体内分布快、消除快，主要分布在血浆等细胞外液中，符合理想光敏剂的特点。
　　4.HB脂质体对小鼠皮肤光毒性低、安全性高。

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前 言

第一部分 HB脂质体光动力治疗微血管病变的药效学研究

实验一 HB脂质体对鼠肺血管内皮细胞光动力杀伤效应及暗毒性研究

实验二 氪离子激光诱导BN大鼠CNV模型的建立

实验三 HB脂质体光动力治疗BN大鼠实验性CNV的疗效观察

第二部分 HB脂质体在小鼠体内的药代动力学研究

引 言

材料与方法

结果

讨论

小 结

第三部分 静脉注射HB脂质体对小鼠皮肤光毒性的研究

引言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

全文总结

创新点及展望

文献综述

参考文献

博士在读期间发表文章

致谢