半月板基质及松质骨源性的复合半月板支架修复兔内侧半月板缺损的实验研究

摘要

实验目的:半月板损伤后难以自行修复，如何实现半月板的再生是医学界面临的巨大挑战，本课题的研究目的:1.利用脱细胞半月板基质及脱矿松质骨成功构建脱细胞半月板基质支架、脱矿松质骨支架及脱细胞半月板基质/脱矿松质骨支架等三种组织工程半月板支架，并比较其理化学特性及动物体内免疫排斥反应;2.利用兔半月板纤维软骨细胞(Meniscal Fibrochondrocytes，MFC)观察三种支架的细胞毒性，细胞相容性及对纤维软骨细胞袁型的影响;3.分别将三种支架原位植入兔内侧半月板缺失模型中，观察其促进半月板再生情况以及对膝关节软骨保护情况。
　　实验方法:1.通过物理化学方法制备脱细胞半月板基质水凝胶，利用改良Urist法制备脱矿松质骨，最后利用真空灌注，模具塑形及冷冻干燥的方法制备三种不同的半月板支架;2.三种支架的理化学特性检测:利用扫描电镜观察其微观结构，利用组织学及生物化学方法检测其组成成分，利用BOSE生物力学机检测其拉伸及压缩弹性模量;3.分别将三种支架植入SD大鼠皮下观察其免疫排斥反应;4.将兔半月板纤维软骨细胞分别种植到三种支架上，利用扫描电镜观察其细胞生长微观结构，利用死活染色观察三种支架的细胞毒性，利用DNA、GAG及胶原定量分析生长在三种不同支架上的纤维软骨细胞在3、7、14天时细胞增殖及分泌GAG和胶原情况;5.将三种支架原位植入兔内侧半月板缺失模型中，并分别于3月、6月时处死取材，利用大体观、组织学、X-RAY、MRI、生物力学测试及RT-PCR检测观察半月板再生情况及对膝关节关节软骨保护情况。
　　实验结果:1.扫描电镜结果显示三种支架均具有良好的孔隙率及三维孔隙结构;脱细胞半月板基质支架及脱细胞半月板基质/脱矿松质骨支架比脱矿松质骨支架具有更高的GAG含量(P＜0.05);脱细胞半月板基质/脱矿松质骨支架与脱细胞半月板基质支架及脱矿松质骨支架相比具有更好的生物力学特性(P＜0.05);三种支架种植于大鼠皮下均未见明显的免疫排斥反应;2.兔半月板纤维软骨细胞均可在三种支架上生长，死活染色结果显示其细胞存活率差异无统计学差异;其细胞增殖及分泌GAG和胶原结果显示:在7天和14天时种植于脱细胞半月板基质支架和脱细胞半月板基质/脱矿松质骨支架上的纤维软骨细胞其细胞增殖及分泌GAG和胶原能力均比种植于脱矿松质骨支架上的高(P＜0.05)。3.兔体内原位植入结果显示，空白缺损组及脱细胞半月板基质组均未见明显的新生半月板组织，仅有少量滑膜再生，脱细胞半月板基质/脱矿松质骨支架组及脱矿松质骨组可见明显的新生半月板组织，新生半月板组织学Ishida评分显示脱细胞半月板基质/脱矿松质骨支架组明显优于脱矿松质骨组(P＜0.05)，相对应的股骨髁及胫骨平台软骨Mankin评分结果显示脱细胞半月板基质/脱矿松质骨支架组也明显优于其余三组(P＜0.05)，X线K-L分级评分及核磁共振WORMS评分也均显示脱细胞半月板基质/脱矿松质骨支架组优于其余三组(P＜0.05)，新生半月板拉伸力学测试结果显示随着植入时间的延长其拉伸力学性能增强，并且在同一时间点脱细胞半月板基质/脱矿松质骨组要优于脱矿松质骨组(P＜0.05)，同时新生半月板mRNA表达结果显示，随着植入时间的延长其Aggrecan、Sox9和CollagenⅡ表达均上升(P＜0.05)，并且脱细胞半月板基质/脱矿松质骨支架组的表达量高于脱矿松质骨组(P＜0.05)。
　　实验结论:脱细胞半月板基质/脱矿松质骨半月板支架具有良好的三维孔隙结构，相对于单纯脱矿松质骨支架和脱细胞半月板基质支架相比具有更好的生物力学特性，并且可以促进兔半月板纤维软骨细胞增殖及分泌GAG和胶原成分。兔体内原位植入实验结果显示，脱细胞半月板基质/脱矿松质骨支架可以实现半月板的完全再生，并且可以保护关节软骨，阻止骨关节炎的发生，是一种良好的组织工程半月板支架材料。

目录

声明

摘要

引言

参考文献

第一部分 三种半月板支架的制备及理化特性研究

目的

材料与方法

一、主要的试剂及耗材

二、主要的设备

三、实验方法

四、统计学方法

结果

一、半月板基质脱细胞前后的比较

二、脱细胞半月板基质支架、脱矿松质骨支架及脱细胞半月板基质／脱矿松质骨支架的制备及理化学和组织学特性比较

三、三种支架的生物力学特性比较

四、三种支架的大鼠皮下免疫排斥反应

讨论

结论

参考文献

第二部分 三种半月板支架的细胞相容性研究

目的

材料与方法

一、主要的试剂及耗材

二、主要的设备

三、实验方法

四、统计学方法

结果

一、半月板纤维软骨细胞种植于三种半月板支架

二、扫描电镜观察

三、死活细胞检测

四、纤维软骨细胞增殖及分泌胶原、糖胺多糖情况

讨论

结论

参考文献

实验三 三种支架修复兔内侧半月板缺损的实验研究

目的

材料与方法

一、主要的试剂及耗材

二、主要的设备

三、实验方法

四、统计学方法

结果

一、大体观

二、新生半月板组织学

三、软骨保护作用

四、X线检查结果

五、MRI检查结果

六、RT-PCR检查结果

七、力学检查结果

讨论

结论

参考文献

缩略词表

文献综述

致谢