基于细胞穿膜肽修饰的新型非病毒载体的构建、筛选及递送功能siRNA治疗恶性肿瘤的研究

摘要

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一类疾病。据世界卫生组织报告，全球新确诊和死于癌症的人数都在逐年增加，肿瘤的治疗已经成为重大研究课题。siRNA药物通过诱导RNA干扰(RNAi)效应为抗肿瘤治疗提供了一种有前景的手段。但是，siRNA药物本身半衰期短、稳定性差、易被核酸酶降解、亲水性强且带负电，所以不易透过带负电荷的细胞膜进入细胞发挥治疗作用。缺乏能够高效率递送siRNA载体的现状严重限制了其应用。本课题构建和筛选出能够高效递送siRNA的非病毒载体，并应用筛选出的载体加载siRNA制备纳米粒，进行体内外抗肿瘤治疗研究。
　　 首先，通过化学反应分别将6种细胞穿膜肽(CPPs)共价结合到壳聚糖高分子链游离氨基末端，制备6种CPP-g-CS载体，并利用FTIR和1H NMR等分析方法对其结构进行鉴定。然后选用不同类型的细胞，通过MTT实验对CPP-g-CS载体进行细胞毒性评价，结果表明6种载体的细胞存活率均＞87％。以复凝聚法制备载siRNA纳米粒，对其形态、粒径、Zeta电位、稳定性等理化性质进行研究，结果显示所制备的纳米粒是表面带有+18.58mV的正电荷、大小为200 nm左右的球形粒子，粒径分布范围较窄。
　　 以不同CPP-g-CS为载体，选用干扰荧光素酶报告基因(luciferase)表达的siRNA为模型药物，通过报告基因分析探讨纳米粒沉默luciferase基因表达的规律。筛选出高效递送siRNA沉默靶基因表达的载体，结果表明TAT-g-CS/siRNA及6R-g-CS/siRNA的靶基因沉默能力最强，对外源性基因的抑制效率分别达到了73.7％和64.9％;对内源性基因的抑制效率分别达到75.3％和64.92％。同时利用激光共聚焦观察纳米粒的入胞情况，流式细胞术研究了其摄取效率及转染机制，并考察了时间和剂量因素对靶基因沉默效率的影响。
　　 选择靶向Survivin和Bcl-2基因的功能性siRNA制备纳米粒，研究纳米粒对肿瘤细胞体外杀伤效果。结果表明siRNA剂量为50 pmol/孔，孵育48小时后，两种纳米粒抑制细胞增殖的效率达到最大，分别为55.6％和52.8％，诱导细胞产生凋亡比例分别为98.77％和99.2％。
　　 选择筛选出来的载体加载靶向Survivin和Bcl-2基因的功能性siRNA制备纳米粒，对荷瘤小鼠进行瘤内注射治疗乳腺癌，通过传统肿瘤监测手段测量肿瘤体积的变化、解剖学观察肺组织表面转移灶的多少和瘤重的差异，经病理切片分析肺组织表面的病理变化，综合评价载功能性siRNA纳米粒体内抗肿瘤生长、转移的效果及对荷瘤小鼠生存率的影响。结果显示两种纳米粒都可以显著抑制小鼠乳腺癌的生长及转移，并能有效延长荷瘤小鼠的生存期。同时，应用活体动物成像技术观察TAT-g-CS/siRNASur纳米粒抑制肿瘤转移的效果，结果也确证了TAT-g-C S/siRNAsur纳米粒能够有效抑制肿瘤转移。
　　 本课题用6种CPP对壳聚糖进行结构修饰，通过探讨不同载体对靶基因表达的沉默效率，筛选获得高效siRNA递送载体，相对于仅用一种材料进行修饰而无筛选过程的其他同类研究，本课题的设计思路更加科学，更容易获得预期目标及较理想的结果。另外，目前关于siRNA递送的研究大都止于报告基因或者治疗基因的体外研究。而本课题应用筛选出的载体加载2种治疗性siRNA制备纳米粒，进行动物体内抗肿瘤研究，评价载siRNA纳米粒的肿瘤治疗效果及其对荷瘤小鼠生存率的影响，同时应用活体动物成像观察纳米粒抑制肿瘤转移的效果，结果表明载功能siRNA纳米粒在体内外均取得良好的治疗效果。为siRNA递送载体的研发提供理论依据、方法参考和技术借鉴。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 CPP-g-CS载体的合成、结构表征及细胞毒性评价

第一节 不同CPP-g-CS载体的合成及结构表征

一、仪器、材料与试剂

二、实验部分

三、实验结果

第二节 不同CPP-g-CS载体的细胞毒性评价

一、仪器与试剂

二、实验部分

三、实验结果

四、讨论

本章小结

参考文献

第二章 载siRNA纳米粒的制备及表征

第一节 纳米粒制备工艺的优化

一、仪器与试剂

二、实验部分

三、实验结果

第二节 纳米粒理化性质的研究

一、仪器、材料与试剂

二、实验部分

三、实验结果

四、讨论

本章小结

参考文献

第三章 载siRNA纳米粒沉默靶基因能力的研究

一、实验材料

二、实验部分

2．1 质粒的制备

2．2 载siRNA纳米粒抑制外源基因Luciferase表达的研究

2．3、载siRNA纳米粒抑制内源性基因表达的研究

2．4 Luciferase活力的测定

三、实验结果

3．1 质粒的扩增、提取、鉴定

3．2 载siRNA纳米粒抑制外源性Luciferase基因表达的研究

3．3 纳米粒抑制内源性Luciferase表达的研究

四、讨论

本章小结

参考文献

第四章 载siRNA纳米粒体外细胞摄取机制研究

一、仪器与试剂

二、实验部分

2．1 细胞摄取效率的影响因素研究

2．2 流式细胞仪检测纳米粒摄取情况

2．3 激光共聚焦观察纳米粒入胞情况

2．4 TAT-g-CS／siRNA纳米粒入胞机制的研究

三、实验结果

3．1．细胞摄取研究

3．2 激光共聚焦观察细胞入胞情况

3．3 TAT-g-CS／siRNA纳米粒摄取机制研究结果

四、讨论

本章小结

参考文献

第五章 载功能siRNA纳米粒的体外肿瘤细胞杀伤研究

第一节 靶向Survivin纳米粒的体外肿瘤细胞杀伤效果

一、仪器及试剂

二、实验部分

三．实验结果

第二节 靶向Bcl-2的纳米粒体外肿瘤细胞杀伤效果

一、仪器及试剂

二、实验部分

三、实验结果

四、讨论

本章小结

参考文献

第六章 载治疗siRNA纳米粒的动物体内抗肿瘤研究

第一节 TAT-g-CS／siRNA纳米粒体内抗肿瘤评价

一、仪器、材料、试剂及实验动物

二、实验方法

三、实验结果

第二节 6R-g-CS／siRNA纳米粒体内抗肿瘤评价

一、仪器及试剂

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

本章小结

参考文献

全文总结及展望

综述

作者简介

致谢

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