调控肠道代谢提高药物口服生物利用度的制剂技术研究

摘要

口服药物普遍存在胃肠道首过效应，该类药物在吸收入血之前就已经发生了胃肠道代谢，降低了口服药物的生物利用度。对某些药物而言，胃肠道首过效应对生物利用度的影响超过了肝脏首过效应。与胃肠道首过效应相关的主要有转运蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、Ⅰ相代谢酶细胞色素P450酶系(Cytochrome P450 proteins，CYP450)和Ⅱ相代谢酶尿苷二磷酸葡萄糖转移酶(UDP-glucuronyltransferase，UGT)。本课题分别以P-gp、CYP450和UGT为调控目标，通过制剂技术调控其活性，抑制药物的胃肠道代谢，提高口服生物利用度，并进一步探讨提高药物生物利用度的机制。
　　首先，体外快速筛选了对P-gp、CYP450和UGT具有抑制活性的药用辅料。结果表明，大部分的非离子型表面活性剂和聚合物类药用辅料对3种蛋白均具有一定的抑制活性。同时还筛选出无抑制活性的药用辅料制备阴性参比制剂。
　　药用辅料对P-gp的调控报道较多，文献报道黄酮类化合物对P-gp活性具有调控作用。因此，本课题选择以黄酮类化合物为主要活性成分的酸枣仁来研究对P-gp的调控。体外结果显示，酸枣仁正丁醇萃取部位(STS)可以将罗丹明123的外排率由4.99±0.53降到2.22±0.23，跟维拉帕米(1.34±0.15)相当。体内药代动力学结果显示，STS能将最高血药浓度Cmax和生物利用度AUC0-t分别提高到原药的177％和223％。作用机制研究发现，总黄酮类化合物是STS抑制P-gp活性的主要化学成分，且对P-gp的抑制作用是通过抑制P-gpATP酶活性实现的。该结果提示应当警惕酸枣仁与P-gp底物类药物联用时的潜在风险。
　　对于CYP450的代谢调控，选择中药复方DOS1227为模型药物（主要成分为在胃肠道发生CYP450代谢的原人参三醇PPT和原人参二醇PPD），分别制备了对CYP450具有抑制活性和无抑制活性的中药复方DOS-1227的自微乳制剂，并对其进行表征。结果显示，2种自微乳的理化性质、体外释放性能、细胞摄取能力和肠道淋巴系统吸收特性均无显著性差异，但体内药代动力学结果显示含有CYP450抑制活性的自微乳与无CYP450抑制活性的自微乳比较，PPT和PPD的相对生物利用度分别提高到3.95倍和2.21倍，与游离药物相比分别提高到8.85倍和4.22倍，上述结果证明含抑制活性药用辅料制剂能够通过抑制CYP450的活性来提高药物的口服生物利用度。
　　对于UGT的调控，以白藜芦醇为模型药物，采用了高压均质法制备了质量可控、工艺简单的亚微乳制剂，并分别使用了无抑制活性的辅料(F68-N)和有抑制活性的辅料(Lab-N)，比较了不同亚微乳的体内外代谢特性。结果显示，F68-N和Lab-N具有相似的理化性质、细胞毒性、细胞摄取能力、细胞吞噬途径、肠道淋巴系统吸收特性等，但肠外翻结果显示，Lab-N能明显抑制白藜芦醇的葡萄糖醛酸化代谢，而F68-N则未见显著性抑制作用。体内药代动力学结果显示Lab-N能够将白藜芦醇生物利用度提高到原药组的6.12倍，与F68-N相比提高到5.60倍，同时抑制葡萄糖醛酸化代谢产物的AUC0-12h达46.5％。并且空白亚微乳Lab-N与白藜芦醇的物理混合组并不能抑制白藜芦醇的肠道葡萄糖醛酸化，这说明未将白藜芦醇包封入亚微乳不能起到抑制UGT的作用，这可能是不包封时药用辅料与白藜芦醇吸收不同步造成的。上述结果说明通过使用具有UGT抑制活性的药用辅料制备的亚微乳制剂来调控白藜芦醇的醛酸化代谢的方法可行，Lab-N亚微乳抑制白藜芦醇的肠道葡萄糖醛酸化代谢，并提高了白藜芦醇的口服生物利用度。
　　亚微乳Lab-N中为含有单一抑制UGT活性的药用辅料，因此我们体外评价了不同药用辅料之间联合应用时的协同作用，实验结果显示Labrasol、Labrafil和RH40三种具有抑制活性的药用辅料联合应用，其对UGT的抑制活性大于药用辅料单独使用(P＜0.05)，体外实验结果说明药用辅料对UGT的抑制活性具有协同作用。药用辅料对UGT酶代谢动力学的影响结果显示，Labrasol、Labrafil和RH40三种具有抑制活性的辅料对于白藜芦醇的主要代谢酶UGT1A1为竞争性抑制剂，对于UGT1 A9为混合竞争性抑制剂。
　　最后，为了体内验证药用辅料之间的协同作用，制备更适合口服、具有更强抑制活性的制剂，我们分别制备了含有多种UGT抑制活性药用辅料和无UGT抑制活性的白藜芦醇自微乳，考察了2种自微乳的体内外代谢特性。结果显示，2者的理化性质、细胞毒性、细胞摄取能力、肠道淋巴系统吸收特性等无显著性差异，但实验结果显示有抑制活性的自微乳体外能显著抑制白藜芦醇的葡萄糖醛酸化代谢，体内能够将白藜芦醇生物利用度提高到原药组的12.72倍，与无抑制活性自微乳相比提高6.51倍。上述结果进一步说明含有UGT抑制活性的药用辅料制备的自微乳可以通过调控UGT活性来提高白藜芦醇的口服生物利用度，并且体内验证了多种抑制活性的药用辅料组合可以发挥协同作用。
　　综上所述，本文通过使用酸枣仁提取物调控P-gp，提高了其底物的口服生物利用度。同时使用含有CYP450或UGT抑制活性的药用辅料的制剂技术来抑制胃肠道代谢，提高口服药物的生物利用度，并阐明了对UGT和P-gp的抑制的作用机制，为解决口服药物的胃肠道首过效应的瓶颈问题，及药剂学领域提高口服药物生物利用度的研究和开发提供了理论依据和方法参考。

目录

中英文缩略词

摘要

前言

一、P-糖蛋白(P-gp)

二、细胞色素P450酶系(CYP450)

三、尿苷二磷酸葡萄糖转移酶(UGT)

四、小结

五、本课题研究目的和意义

参考文献

第一章 药用辅料的体外抑制活性筛选

一、仪器与材料

1．1 仪器

1．2 药品与试剂

1．3 实验动物

二、实验方法

2．1 罗丹明123体外分析方法的建立

2．2 PPT和PPD的HPLC-MS／MS体外分析方法学的建立

2．3 白藜芦醇体外分析方法学的建立

2．4 Caco-2细胞培养

2．5 缓冲工作液的配置

2．6 MTT法筛选药用辅料对Caco-2细胞的无毒性剂量

2．7 96孔板荧光法快速筛选对P-gp具抑制作用的药用辅料

2．8 差速离心法制备大鼠肝微粒体

2．9 BCA法测定肝微粒体中总蛋白质的含量

2．10 肝微粒体法筛选对PPD的CYP450 Ⅰ相代谢具有抑制活性的药用辅料

2．11 肝微粒体法筛选对PPT的CYP450 Ⅰ相代谢具有抑制活性药用辅料

2．12 肝微粒体法筛选对UGT具有抑制活性药用辅料

2．13 统计学分析

三、实验结果与讨论

3．1 罗丹明123体外分析方法学的建立

3．2 PPT和PPD的HPLC-MS／MS体外分析方法学的建立

3．3 白藜芦醇体外分析方法学的建立

3．4 药用辅料对Caco-2细胞的无毒性剂量筛选研究

3．5 药用辅料对P-gp的抑制活性筛选研究

3．6 肝微粒体中总蛋白含量测定

3．7 药用辅料对PPD和PPT的CYP450 Ⅰ相代谢抑制活性研究

3．8 药用辅料对白藜芦醇的UGTⅡ相代谢抑制活性研究

本章小结

参考文献

第二章 酸枣仁提取物对P-gp抑制活性的实验研究

一、仪器与材料

1．1 仪器

1．2 药品与试剂

1．3 实验动物

二、实验方法

2．1 Caco-2细胞培养

2．2 缓冲工作液的配置

2．3 酸枣仁提取物的制备与纯化

2．4 酸枣仁提取物对Caco-2的细胞毒性研究

2．5 酸枣仁提取物对细胞内罗丹明123积累的影响

2．6 酸枣仁提取物对罗丹明123在Caco-2单层细胞模型转运的影响研究

2．7 酸枣仁提取物对Caco-2细胞P-gp ATP酶活性影响

2．8 酸枣仁提取物对罗丹明123口服生物利用度的影响

2．9 大鼠血浆处理方法和罗丹明123检测方法学的建立

2．10 统计学分析

三、实验结果与讨论

3．1 酸枣仁各部分提取物的含量与产率

3．2 酸枣仁提取物对Caco-2细胞毒性实验研究

3．3 酸枣仁提取物对Caco-2细胞内罗丹明123积累的影响

3．4 酸枣仁提取物对罗丹明123在Caco-2单层细胞模型转运的影响

3．5 酸枣仁提取物对P-gp ATP酶活性影响

3．6 罗丹明123体内测定的方法学的建立

3．7 酸枣仁提取物对罗丹明123药代动力学影响

本章小结

参考文献

第三章 自微乳对CYP450抑制活性的实验研究

一、仪器与材料

1．1 仪器

1．2 药品与试剂

1．3 实验动物

二、实验方法

2．1 PPT、PPD、Rh1和Rh2的HPLC-MS／MS生物样品分析方法学的建立

2．2 缓冲工作液的配置

2．3 伪三元相图的绘制

2．4 DOS-1227自微乳的制备

2．5 DOS-1227自微乳理化性质的表征

2．6 DOS-1227自微乳体外释放

2．7 DOS-1227自微乳离体肠外翻实验

2．8 Caco-2细胞培养

2．9 DOS-1227自微乳的Caco-2细胞毒性研究

2．10 Caco-2细胞对DOS-1227自微乳的摄取研究

2．11 DOS-1227自微乳的Caco-2单层细胞模型转运研究

2．12 DOS-1227自微乳在肠道淋巴系统吸收的研究

2．13 DOS-1227自微乳口服药代动力学研究

2．14 统计学分析

三、实验结果与讨论

3．1 生物样品中PPT、PPD、Rh1和Rh2的体内分析方法学的建立

3．2 自微乳的伪三元相图绘制

3．3 DOS-1227自微乳的制备与表征

3．4 肠外翻实验考察自微乳对DOS-1227中PPT和PPD等的吸收

3．5 DOS-1227自微乳对Caco-2细胞的细胞毒性研究

3．6 Caco-2细胞对DOS-1227自微乳的摄取研究

3．7 DOS-1227自微乳的单层细胞模型转运研究

3．8 DOS-1227自微乳在肠道淋巴系统吸收研究

3．9 DOS-1227自微乳体内药代动力学研究

本章小结

参考文献

第四章 亚微乳对肠道白藜芦醇葡萄糖醛酸化抑制的研究

一、仪器与材料

1．1 仪器

1．2 药品与试剂

1．3 实验动物

二、实验方法

2．1 生物样品中白藜芦醇及其醛酸化代谢产物体内分析方法学的建立

2．2 缓冲工作液的配置

2．3 白藜芦醇亚微乳的制备

2．4 白藜芦醇亚微乳理化性质的表征

2．5 白藜芦醇亚微乳体外释放

2．6 白藜芦醇亚微乳离体肠外翻实验

2．7 Caco-2细胞培养

2．8 白藜芦醇亚微乳的Caco-2细胞毒性研究

2．9 Caco-2细胞对亚微乳的摄取研究

2．10 Caco-2细胞对亚微乳的吞噬途径研究

2．11 白藜芦醇亚微乳的Caco-2单层细胞模型转运研究

2．12 白藜芦醇亚微乳在肠道淋巴系统吸收的研究

2．13 白藜芦醇亚微乳口服药代动力学研究实验方法

2．14 统计学分析

三、实验结果与讨论

3．1 生物样品中白藜芦醇及其醛酸化代谢产物体内分析方法学的建立

3．2 白藜芦醇亚微乳制备与表征

3．3 肠外翻实验考查亚微乳对白藜芦醇吸收和代谢抑制作用研究

3．4 白藜芦醇亚微乳对Caco-2细胞的细胞毒性研究

3．5 Caco-2细胞对亚微乳的摄取与吞噬机制研究

3．6 白藜芦醇亚微乳的单层细胞模型转运研究

3．7 白藜芦醇亚微乳在肠道淋巴系统吸收研究

3．8 白藜芦醇亚微乳体内药代动力学研究

本章小结

参考文献

第五章 药用辅料对UGT的酶代谢动力学的影响研究

一、仪器与材料

1．1 仪器

1．2 药品与试剂

二、实验方法

2．1 白藜芦醇和白藜芦醇醛酸化产物体外UPLC分析方法学的建立

2．2 肝微粒体法测定白藜芦醇的酶反应动力学参数

2．3 药用辅料对白藜芦醇酶反应动力学的影响实验研究

2．4 统计学分析

三、实验结果与讨论

3．1 白藜芦醇酶反应动力学研究

3．2 药用辅料对白藜芦醇UGT酶反应动力学影响

本章小结

参考文献

第六章 自微乳对肠道白藜芦醇葡萄糖醛酸化抑制的研究

一、仪器与材料

1．1 仪器

1．2 药品与试剂

1．3 实验动物

二、实验方法

2．1 生物样品中白藜芦醇及其醛酸化代谢产物体内分析方法学的建立

2．2 缓冲工作液的配置

2．3 白藜芦醇在不同溶剂中的表观溶解度的考察

2．4 伪三元相图的绘制

2．5 白藜芦醇自微乳的制备

2．6 白藜芦醇自微乳理化性质的表征

2．7 白藜芦醇自微乳体外释放

2．8 白藜芦醇自微乳离体肠外翻实验

2．9 Caco-2细胞培养

2．10 白藜芦醇自徽乳的Caco-2细胞毒性研究

2．11 Caco-2细胞对白藜芦醇自微乳的摄取研究

2．12 白藜芦醇自微乳的Caco-2单层细胞模型转运研究

2．13 白藜芦醇自徼乳在肠道淋巴系统吸收的研究

2．14 白藜芦醇自微乳口服药代动力学研究实验方法

2．15 统计学分析

三、实验结果与讨论

3．1 白藜芦醇在不同溶剂中的表观溶解度

3．2 伪三元相图的绘制

3．3 白藜芦醇自微乳的制备与表征

3．4 肠外翻实验考查自微乳对白藜芦醇吸收和代谢抑制作用研究

3．5 白藜芦醇自微乳对Caco-2细胞的细胞毒性

3．6 Caco-2细胞对自藜芦醇自微乳的摄取研究

3．7 白藜芦醇自微乳的单层细胞模型转运研究

3．8 白藜芦醇自微乳在肠道淋巴系统吸收研究

3．9 白藜芦醇自徼乳体内药代动力学研究

本章小结

参考文献

全文总结及展望

作者简介

致谢

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