虎杖苷减轻丙酮醛对许旺细胞的损伤及相关作用机制的研究

摘要

研究背景： 难治性创面的修复是整形外科领域的难题，糖尿病引起的末梢周围神经及其营养血管的功能障碍是难治性创面出现的常见原因。而体内长期高糖状态引起糖基化终产物(AGE)的大量堆积，是糖尿病末梢周围神经病变的主要发病机制。丙酮醛(MGO)是AGE的前体，在糖尿病时明显升高，与糖尿病引起的组织细胞损伤密切相关。 虎杖苷(polydatin,PD)是白藜芦醇的主要活性成分，具有十分广泛的药理学活性，能够显著抑制炎症反应和氧化应激反应，对休克、缺血再灌注损伤、心力衰竭、糖尿病肾脏损伤及糖尿病心血管病变等具有明显的保护作用。然而，PD对糖尿病引起的周围神经系统功能障碍是否具有保护作用及具体的作用机制目前并不十分清楚。 研究目的： 本研究采用周围神经系统的许旺细胞作为观察对象，采用MGO损伤许旺细胞，探讨PD对MGO引起的许旺细胞损伤是否具有保护作用及具体的作用机制，为糖尿病周围神经病变的损伤修复提供新的思路，从而进一步指导难治性创面的修复。本研究主要从以下几个方面进行。 1.探讨MGO对许旺细胞的损伤作用 2.明确PD能否防御MGO对许旺细胞的短期损伤(6h) 3.明确PD能否防御MGO对许旺细胞的长期损伤(24h) 4.探讨PD保护许旺细胞的相关作用机制 研究方法： 1.大鼠许旺细胞系RSC96细胞采用96孔板体外培养48h后，改用无血清的高糖培养基培养12h，此时细胞密度达到80％～85％。随后，加入不同浓度的MGO（1000μM、1200μM、1400μM、1600μM、1800μM）分别继续培养6h和24h。CCK-8检测许旺细胞活性，寻找MGO的半数抑制浓度IC50值。 2.大鼠许旺细胞系RSC96细胞体外培养48h后，改用无血清的高糖培养基培养12h，同时加入不同浓度的PD(50μM、100μM、150μM)预处理细胞12h，随后加入IC50值浓度的MGO损伤细胞6h、24h。分别采用CCK-8检测、乳酸脱氢酶(LDH)释放量分析、活性氧(ROS)含量分析、线粒体膜电位变化分析、细胞内ATP含量分析、凋亡分析来观察PD对许旺细胞损伤早期和晚期的保护作用。 3.采用Western blot检测分析许旺细胞损伤早期和晚期细胞内糖基化终产物受体(RAGE)、乙二醛酶1(GLO1)、Nrf2/Keap1的表达情况。 研究结果： 1.MGO对许旺细胞损伤的评价 采用CCK-8检测发现，与正常对照组相比，MGO对许旺细胞的损伤呈现剂量依赖性，其作用6h和24h的IC50值均为1650μM左右。此时许旺细胞的形态结构也发生明显异常。 2.PD对受损许旺细胞活性的影响 PD预处理12h后，CCK-8检测细胞活性发现，与MGO损伤组相比，PD预处理的许旺细胞活性明显增强。LDH释放量检测分析细胞损伤程度发现，与对照组相比，MGO刺激后，许旺细胞LDH释放量明显增多;而PD预处理可以减少因MGO引起的LDH释放。以上证实PD对许旺细胞具有明显的保护作用。 3.PD对受损许旺细胞氧化应激水平的影响 与正常组相比，MGO可诱导许旺细胞产生大量的ROS，氧化应激水平增高。PD预处理可以明显降低细胞内的ROS含量，降低氧化应激水平。 4.PD对受损许旺细胞线粒体功能的影响 MGO可损伤许旺细胞的线粒体，表现为线粒体膜电位降低，细胞内ATP含量减少;而PD预处理可以明显减轻细胞的线粒体损伤，促进ATP合成，提高ATP含量。 5.PD对受损许旺细胞凋亡的影响 采用Muse检测发现，MGO可诱导许旺细胞凋亡;而PD预处理则可以减少许旺细胞的凋亡水平。 6.PD抑制许旺细胞的AGE-RAGE通路，激活Nrf2/GLO1通路，从而发挥保护作用Western blot检测结果显示，与MGO损伤组相比，PD预处理组中的Nrf2被激活，Keap1被抑制，Nrf2下游的靶蛋白GLO1的蛋白表达量也增高;而RAGE的表达量显著降低，导致AGE和RAGE的结合被抑制。 研究结论： 1.MGO对许旺细胞的损伤呈剂量依赖性，其IC50值约为1650μM。 2.MGO对许旺细胞的损伤主要表现为氧化应激和线粒体功能障碍，与体内糖尿病周围神经病变时许旺细胞的损伤表现相一致。 3.PD可以降低受损许旺细胞的氧化应激水平，改善细胞活性和线粒体功能，抑制细胞凋亡。 4.PD发挥保护作用与Nrf2/GLO1信号通路被激活，AGE-RAGE通路被抑制有关。

目录

摘要

前言

第一章丙酮醛对许旺细胞损伤的研究

材料和方法

研究结果

讨论

结论

第二章虎杖苷对许旺细胞的保护作用

材料和方法

研究结果

讨论

结论

第三章虎杖苷保护许旺细胞的作用机制研究

材料和方法

研究结果

讨论

结论

全文总结

综述

参考文献

全文图片

英文缩略词

致谢

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