抗体亲和力的体外定向进化及一种连续定向进化系统的搭建

摘要

蛋白质生物分子进行进化以来已经历经数十年，一般目标分子的进化必需经历如下过程:目标分子基因水平DNA序列随机化（建DNA库），利用感受态转化方法将DNA库导入宿主菌（建有生物活性库），根据与靶标分子相互作用结合能力强弱不同筛选出阳性突变体（筛选），将筛选获得DNA分子再次转入宿主菌，进行下一轮筛选，循环往复，直至最终获得期望性能的一个甚至数个突变体，完成目标分子定向进化。本课题选择传统噬菌体展示技术这种体外进化方法对人源化抗ErbB2抗体HuA21进行亲和力改造。
　　几十年来，噬菌体展示技术被广泛用于抗体亲和力成熟。随着技术的发展，其更有效更广泛的应用却受限于两点:抗体库序列有限的多样性和对筛选后高亲和力抗体突变体冗余复杂且耗时的鉴定。本课题我们将介绍一种新型的抗体库构建和筛选方法用以解决该问题。首先，利用微扰突变(SPM)的方法对该人源化抗ErbB2抗体，HuA21的多个CDR区分别进行定点多样化:用NWG，NWC，NSG三类简并密码子引入氨基酸饱和突变能够同时避免引入半胱氨酸和终止密码子。在两块芯片上共合成并洗脱了7749条简并寡核苷酸用以构建五个单链抗体库(ScFv)，其总库容为4×106DNA序列多样性。通过Illumina平台对未筛选及筛选后的噬菌体库进行高通量测序使我们能够深度了解CDR序列及氨基酸组成的丰度。高通量测序技术用于鉴定筛选后有效的高亲和力抗体，这样能够跨过初级的靶标特异性鉴定过程。为了判断高通量测序鉴定方法的可信度，我们随后综合HTS结果中四个CDR库的前十个丰度最高的序列构建了一个组合库并进行筛选，最终获得了亲和力提高158倍（Ka=25.5pM）的一个抗体突变体。这些结果预示我们的方法在优化抗体和其他生物分子结合能力方面的潜在应用。
　　该传统体外展示用以进化的方法其不足之处在于受限于构建的突变库的库容、筛选的有效性，并且每一轮筛选都需要连续的人力输入，低效而且耗时。近几年，David R Liu实验室创建的PACE系统(phage assisted continuous directedevolving)在快速简化生物大分子定向进化上功效颇高，能帮助研究者解决如上传统进化方法必然出现的问题。该PACE定向进化系统包括一个体积固定的培养瓶，新鲜的宿主菌源源不断的流入，被大瓶中预置的包含靶标基因的噬菌体侵染后该噬菌体/宿主菌混合物再源源不断流出。该系统将噬菌体侵染能力与靶标基因的特定功能偶联，使得特定噬菌体的富集依赖于靶标基因的功能提高。所以，噬菌体复制/侵染一代就等于传统方法中的一轮突变筛选而且不需要人力投入。但是近几年PACE系统自被报道以来，其发展仅局限于David R Liu一处实验室，广泛使用有待发展。因此，本课题中，我们在本实验室尝试用PACE系统定向进化rpoD基因(Sigma70因子)使其编码蛋白最终能够和无关DNA序列有较强且特异性的相互作用。我们计划构建该系统后将其用于人工合成无功能蛋白的功能赋予。目前我们还在进一步的摸索实验来搭建该系统。

目录

声明

摘要

第一部分 结合高通量DNA合成和测序的噬菌体展示技术用于抗体亲和力成熟研究

第一章 绪论

1．1 ErbB2过表达与肿瘤发生

1．2 噬菌体展示及抗体工程化

1．3 高通量芯片合成及高通量测序技术

第二章 实验材料和方法

2．1 实验材料，仪器和试剂

2．2 实验方法

第三章 实验结果

3．1 实验背景简介

3．2 实验结果

第四章 讨论及总结

4．1 讨论

4．2 总结

第二部分 噬菌体辅助的生物大分子连续定向进化

第一章 绪论

1．1 细菌转录装置关键元件

1．2 实验室经典定向进化

1．3 噬菌体辅助连续定向进化

第二章 实验材料和方法

2．1 实验材料，仪器和试剂

2．2 实验方法

第三章 实验结果、讨论及总结

3．1 前期研究背景及噬菌体系统

3．2 实验结果

3．3 讨论

3．4 总结

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的研究成果