MERS冠状病毒主蛋白酶与N3抑制剂复合物的结构功能研究及SARS冠状病毒解旋酶的晶体学研究

摘要

自2012年起，一种新型冠状病毒——中东呼吸综合征冠状病毒(MiddleEast Respiratory Syndrome coronavirus，MERS-CoV)持续在中东地区蔓延，已造成上百例感染病例，致死率高达50％。这是继2003年爆发的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus，SARS-CoV)、2004年发现的人类冠状病毒NL63(Human Coronavirus NL63，HCoV-NL63)以及2006年发现的人类冠状病毒HKU1（Human Coronavirus HKU1，HCoV-HKU1）之后发现的又一个人类冠状病毒家族的新成员，这表明冠状病毒对人类健康的威胁始终存在，然而到目前为止，在世界范围内还没有切实有效的能用于临床治疗MERS-CoV、SARS-CoV等冠状病毒感染的疫苗或特效药物。　　冠状病毒作为单股正链RNA病毒，编码约16个非结构蛋白(non-structuralproteins，nsps)介导自身的转录复制过程。这其中，nsp5（即主蛋白酶）参与将冠状病毒基因组编码的复制酶多蛋白(polyproteins，ppla，pplab)酶切水解为病毒基因组复制所必需的16个非结构蛋白的过程，因而在冠状病毒的转录复制中发挥了至关重要作用。并且在人体内不存在nsp5的同源蛋白，因而nsp5蛋白是一个良好的抗冠状病毒靶点。　　本论文首先运用分子置换法解析了MERS-CoV nsp5与N3抑制剂复合物的2.27(A)晶体结构，分析了nsp5与N3抑制剂间的精确相互作用，验证了MERS-CoV nsp5以同源二聚体的形式发挥活性功能，以Cys-His二体构成催化活性中心，为理解N3抑制MERS-CoV nsp5的反应机理提供了良好的结构基础;并且我们通过体外构建的荧光酶活体系定量分析了N3分子对MERS-CoV nsp5的抑制活性，从结构和功能两方面证实了N3确实是MERS-CoV nsp5的良好抑制剂;其次，我们比较并分析了冠状病毒亚科不同成员(MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-HKU1和IBV)的nsp5结合N3抑制剂的高度结构保守性及轻微差异，期望为抗MERS-CoV的抑制剂开发提供优化指导。　　本论文的另外一部分工作为SARS-CoV nsp13蛋白的蛋白质晶体学研究。nsp13具有解旋酶及NTPAse酶功能，是冠状病毒转录复制过程不可缺少的核心酶之一，也是一个良好的抗冠状病毒药物靶点。在本论文中，我们通过合理的分子克隆构建及有效的蛋白表达纯化手段，获得了SARS-CoV nsp13母体晶体的X射线衍射数据(2.9(A))，为最终解析SARS-CoV nsp13的三维结构奠定了良好的基础。

目录

声明

摘要

主要符号对照表

第一章 引言

第一节 选题背景及意义

第二节 冠状病毒的研究简史、分类和引发的疾病

1．2．1 冠状病毒的研究简史

1．2．2 冠状病毒的分类

1．2．4 冠状病毒引起的疾病

1．2．5 冠状病毒引起的疾病的防治

第三节 冠状病毒的研究概况

1．3．1 冠状病毒的基因组结构

1．3．2 冠状病毒的生活周期

1．3．3 冠状病毒的复制转录机制

1．3．4 冠状病毒RTC的组成

第四节 MERS-CoV nsp5的研究意义

1．4．1 冠状病毒nsp5的研究意义

1．4．2 冠状病毒nsp5的研究现状

1．4．2 冠状病毒nsp5抑制剂的研究现状

1．4．3 冠状病毒nsp5及其抑制剂研究过程中的注意点

1．4．4 MERS-CoV nsp5与N3复合物结构的研究意义

第五节 本课题的研究内容与意义

第六节 论文结构安排

第二章 MERS-CoV nsp5与抑制剂N3的复合物晶体制备

第一节 MERS-CoV nsp5的基本信息

2．1．1 MERS-CoV nsp5的基因序列

2．1．2 MERS-CoV nsp5的生物化学信息

2．1．3 MERS-CoV nsp5折叠情况预测

2．1．4 MERS-CoV nsp5的同源蛋白分析

2．1．5 小结

第二节 MERS-CoV nsp5基因的克隆与表达载体的优化

2．2．1 MERS-CoV nsp5基因的获取

2．2．2 表达系统的选择

2．2．3 表达载体的选择

2．2．4 重组质粒的构建

第三节 MERS-CoV nsp5重组蛋白的表达与纯化

2．3．1 MERS-CoV nsp5重组蛋白的表达

2．3．2 MERS-CoV nsp5重组蛋白的纯化

第四节 MERS-CoV nsp5蛋白的晶体生长与初步数据收集

2．4．1 蛋白质结晶的基本原理

2．4．2 MERS-CoV nsp5结晶条件的初步筛选和优化尝试

2．4．3 MERS-CoV nsp5与N3复合物晶体的生长与优化

第三章MERS-CoV nsp5-N3复合物的结构功能研究

第一节 结构解析原理简介

3．1．1 相位问题的存在

3．1．2 常用结构解析方法简介

第二节 MERS-CoV nsp5-N3复合物的结构解析

3．2．1 数据收集和处理

3．2．2 结构解析过程

第三节 MERS-CoV nsp5与N3复合物的结构分析

3．3．1 MERS-CoV nsp5与N3的总体结构

3．3．2 MERS-CoV nsp5与N3的结合情况分析

第四节 N3分子抑制MERS-CoV nsp5的酶活验证实验

3．4．1 MERS-CoV nsp5的活性检测原理

3．4．2 MERS-CoV nsp5的酶活实验方法

3．4．2 N3对MERS-CoV nsp5的抑制活性

3．4．3 小结

第四章 SARS-CoV nsp13的晶体学研究

第一节 SARS-CoV nsp13的研究进展及意义

4．1．1 SARS-CoV nsp13的功能研究进展

4．1．2 SARS-CoV nsp13结构生物学研究的意义

第二节 SARS-CoV nsp13重组质粒的构建

4．2．1 SARS-CoV nsp13基本信息分析

4．2．2 SARS-CoV nsp13表达载体的选择

4．3．2 SARS-CoV nsp13表达载体的构建

第三节 pGEX-6p-1-nsp13克隆的蛋白表达、纯化与结晶尝试

4．3．1 pGEX-6p-1-nsp13克隆的蛋白表达与纯化

4．3．2 pGEX-6p-1-nsp13野生型和突变体蛋白结晶尝试

第四节 pGEX-28a-nsp13克隆的蛋白表达、纯化与结晶

4．4．1 pGEX-28a-nsp13克隆的蛋白表达与纯化

4．4．2 pGEX-28a-nsp13蛋白的结晶

第五节 pGEX-28a’-nsp13克隆的蛋白表达、纯化与结晶

4．5．1 pGEX-28a’-nsp13克隆的蛋白表达与纯化

4．5．2 pGEX-28a’-nsp13蛋白的结晶

第六节 pET-28a-6×His-nsp13克隆的蛋白晶体制备与数据收集

4．6．1 pET-28a-6×His-nsp13克隆的蛋白表达与纯化

4．6．2 pET-28a-6×His-nsp13蛋白的结晶

4．6．3 pET-28a-6×His-nsp13蛋白质晶体的数据收集和处理

第五章 结论

附录

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果