大肠杆菌、沙门氏菌中重金属抗性基因分布及共同耐药大肠杆菌E308的全基因组测序

摘要

为了研究大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）中重金属抗性基因流行情况及大肠杆菌、沙门氏菌中重金属抗性基因与抗生素、季铵盐(Quaternary ammonium compounds，QACs)消毒剂的耐药表型和耐药基因型的相关性，检测了肉鸡养殖场中分离的79株大肠杆菌、132株沙门氏菌，肉中分离的99株大肠杆菌、162株沙门氏菌中重金属抗性基因，并根据检测的基因型，测定了重金属对菌株的最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentrations，MICs)，分析了大肠杆菌、沙门氏菌中重金属抗性基因与抗生素、消毒剂的耐药表型及基因型相关性。选择了一株对重金属、抗生素及消毒剂同时具有抗性的大肠杆菌E308进行全基因测序，获得了该菌株完整的基因组序列。　　在大肠杆菌、沙门氏菌中共检测出9种重金属抗性基因。在大肠杆菌中，基因zntA（表达对Zn的抗性）检出率最高(P=77.0％)，而zntB（表达对Zn的抗性）的检出率最低(P=0.6％)，zntA-rcnA基因组合在大肠杆菌中最高(P=11.8％)，其次为arsB-zntA-rcnA(P=10.7％)、pcoR-zntA-rcnA（P=8.4％）。肉源大肠杆菌中arsB（表达对As的抗性）和merA（表达对Hg的抗性）的检出率显著高于鸡场源大肠杆菌中的检出率(p＜0.05)。重金属对大肠杆菌的MICs范围为≤12.5mg/L-1600mg/L。其中，Hg2+对大肠杆菌的MICs最小(≤12.5mg/L)，Zn2+、Mn2+对大肠杆菌MICs最高(1600mg/L)。在沙门氏菌中，zntB抗性基因检出率最高(P=87.1％)，而zntA的检出率最低（P=0.3％），基因型chrA-zntB在沙门氏菌中检出率最高(P=19.4％)，其次为zntB(P=14.6％)、pcoR-chrA-zntB(P=6.5％)，27株沙门氏菌未检出任何重金属抗性基因(P=9.2％)。鸡场源沙门氏菌中的arsB检出率显着高于肉源沙门氏菌(p＜0.05)。沙门氏菌对重金属的MICs范围为≤12.5mg/L-1600mg/L。沙门氏菌对Hg2+的MICs最小(≤12.5mg/L)，而沙门氏菌对Cu2+、Zn2+以及Mn2+的MICs最高(1600mg/L)。　　在大肠杆菌中，重金属抗性基因arsB与抗生素耐药性存在相关性(p＜0.05)，但未发现重金属抗性基因和抗生素耐药基因存在相关性。重金属抗性基因arsB和zntA与苯扎氯铵(Benzalkonium chloride，BC)耐药性存在显著相关性(p＜0.01)，重金属抗性基因arsB和pcoR与十六烷基氯化吡啶(Cetylpyridinium chloride，CPC)耐药性存在显著相关性(p＜0.01)。重金属抗性基因arsB、merA、pcoR（表达对Cu的抗性）、zntA、chrA（表达对Cr的抗性）与消毒剂耐药基因存在显著相关性(p＜0.05)。在沙门氏菌中，pcoR和pcoC（表达对Cu的抗性）与抗生素耐药性存在相关性(p＜0.05)，重金属抗性基因均与β-内酰胺类、四环素类、磺胺类、喹诺酮类以及氨基糖苷类抗生素耐药基因存在相关性(p＜0.05)。在沙门氏菌中，arsB、chrA与消毒剂BC耐药性具有相关性(p＜0.05)。重金属抗性基因arsB、chrA与BC、CPC耐药性具有相关性(p＜0.01)，消毒剂耐药基因qacE△1耐药基因与arsB、pcoR和pcoA存在极显著相关性(p＜0.001)。　　通过对大肠杆菌E308全基因组测得的序列进行组装，最终获得10个contigs，组装的contigs总长度为5，350，144bp。对基因组编码基因预测，注释得到5，155个基因，其注释的基因总长为4，484，934bp，占总序列的86.81％。通过组装获得一个长度为4，786，360bp的环状染色体序列，GC含量为50.76％，共预测得到4，658个基因。同时，组装获得四个环状质粒序列，分别命名为pLKSZ01，pLKSZ02，pLKSZ03及pLKSZ04，序列大小分别为111，721bp、113，645bp、61，476bp、92，978bp，质粒类型分别为IncI1，IncF2，IncI2，p0111。　　通过对染色体基因序列进行比对，发现大量编码抗生素、消毒剂、重金属抗性基因以及大量可移动遗传元件(Mobile genetic elements，MGEs)。其中，大多数属于多重耐药外排泵(Multidrug resistance efflux pump，MDR pump)系统。质粒pLKSZ01序列包括了插入序列(Insertionsequences，ISs)、转座子、接合转移区域以及编码大肠菌素1A、大肠菌素1A免疫蛋白、大肠菌素M免疫蛋白的基因。质粒pLKSZ02的可变区包含了12个抗生素耐药基因(blaCTX-M-55、oqxA、oqxB、fosA3、floR、tetA、tetR、strA、strB、sul2、aph(3")-Ⅱ及blaTEM-1）以及大量的ISs。质粒pLKSZ03包含了一个长的Ⅳ型菌毛(TypeⅣpilus，T4Ps)组装系统、Ⅳ型分泌系统(TypeⅣsecretion system，T4SSs)以及携带一个mcr-1基因（表达对多粘菌素的耐药性）。质粒pLKSZ04携带了8个抗生素耐药基因、1个消毒剂耐药基因以及1个重金属Cr抗性基因（blaTEM-1，dfrA1，aadA2，qacE△1，sul1,chrA,mphA,mphR,tetR,tetA）。　　结果表明，重金属抗性基因在大肠杆菌及沙门氏菌中普遍存在，大肠杆菌及沙门氏菌中重金属抗性基因与抗生素耐药性、消毒剂耐药性存在相关性。在大肠杆菌的染色体上存在着大量的重金属抗性基因以及消毒剂、抗生素耐药基因，可能使大肠杆菌同时产生对重金属、消毒剂、抗生素抗性。质粒上携带着大量的抗生素耐药基因，部分耐药基因还能够介导对消毒剂的耐药性，同时对铬(Cr)表达抗性的基因也有发现，表明细菌对三者的抗性基因可能会在细菌之间进行传播，导致细菌对重金属、消毒剂和抗生素的共同耐药。因此，加强畜禽养殖环境中重金属的管理，对控制重金属、抗生素、消毒剂共同耐药菌株的出现以及传播有重要意义。

目录

声明

摘要

前言

第一章大肠杆菌、沙门氏菌中重金属抗性基因分布

1．1材料

1．1．1菌株

1．1．2培养基及试剂

1．1．3实验仪器

1．1．4质控菌株

1．1．5引物

1．2方法

1．3．1大肠杆菌中重金属抗性基因流行情况

1．3．2鸡场源、肉源大肠杆菌重金属抗性基因流行情况

1．3．3重金属对大肠杆菌的MICs

1．3．4沙门氏菌中重金属抗性基因流行情况

1．3．5鸡场源、肉源沙门氏菌重重金属抗性基因流行情况

1．3．6沙门氏菌对重金属MICs

1．4讨论

第二章重金属抗性基因与抗生素、消毒剂耐药性的相关性

2．1材料与方法

2．2结果

2．2．1大肠杆菌重金属抗性基因与抗生素耐药表型、基因型相关性

2．2．2大肠杆菌重金属抗性基因与消毒剂耐药表型、基因型相关性

2．2．3沙门氏菌重金属抗性基因与抗生素耐药表型、基因型相关性

2．2．4沙门氏菌重金属抗性基因与消毒剂耐药表型、基因型相关性

2．3讨论

第三章共同耐药大肠杆菌E308全基因组测序

3．1材料

3．1．1菌株

3．1．2试剂

3．1．3仪器

3．2方法

3．2．1菌株纯化

3．2．2 DNA提取

3．2．3全基因组测序

3．2．4数据处理

3．3结果

3．3．1数据分析

3．3．2大肠杆菌E308染色体基因组序列及耐药基因

3．3．3多重耐药质粒的全长注释及质粒图谱绘制结果

3．4讨论

结论

创新点

展望

参考文献

致谢

附录

研究生期间获奖励及论文发表等情况